非诺贝特对高糖培养肾小球系膜细胞胞外基质产生及降解影响

　　作者：倪连松，金洁娜，郑景晨，沈飞霞 作者单位：温州医学院附属第一医院 内分泌科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的 ：探讨非诺贝特对糖尿病肾病的保护机制。方法：大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常糖浓度(5.5 mmol·L-1，对照组)、高糖浓度(25 mmol·L-1，高糖组)及25 mmol·L-1葡萄糖+非诺贝特100μmol·L-1(非诺贝特组)。CCK-8测定系膜细胞增殖;ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1);明胶酶谱法检测培养上清基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的活性。结果 ：高糖组系膜细胞较对照组出现增殖增加，合成基质蛋白Col-Ⅳ，FN增多，MMP-2及MMP-9活性下降，TIMP-1含量增加，TGF-β1分泌增加。与高糖组比较非诺贝特干预后能完全或部分逆转上述变化。结论 ：非诺贝特能抑制高糖培养的系膜细胞增殖，减少胞外基质合成，增加胞外基质的降解。

　　【关键词】 糖尿病肾病;非诺贝特;肾小球系膜细胞

　　Effects of fenofibrate on the production and degradation of extracellular matrix of glomerular mesangial cells incubated with high concentration of glucose

　　NI Lian-song，JIN Jie-na，ZHENG Jing-chen，SHEN Fei-xia.

　　Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To explore the protective mechanism of fenofibrate on diabetic nephropathy. Methods: Rat mesangial cells (MC) were incubated in media containing 5.5 mmol·L-1 glucose (control group)，25 mmol·L-1 high glucose (HG group) and 25 mmol·L-1 glucose+100μmol·L-1 fenofibrate (FB group). Cellular proliferation was assessed with CCK-8. Fibronectin (FN)， type Ⅳ collagen (Col-Ⅳ)，transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and matrix metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in supernatant were detected with ELISA method. Activities of matrix metalloproteinase-2，9 (MMP-2，9) in supernatant were detected with gelatinase zymography. Results: Compared with control group， MC in HG group showed a high growth rate and synthesis of Col-Ⅳand FN were increased ;activities of MMP-2 and MMP-9 decreased，and secretion of TGF-β1 and TIMP-1 increased. Compared with HG group， these changes could be fully or partly reversed by fenofibrate treatment. Conclusion: Fenofibrate can inhibit high glucose-induced proliferation of mesangial cells， decrease synthesis of extracellular matrix， and increase degradation of extracellular matrix.

　　Key words: diabetic nephropathy;fenofibrate;mesangial cells

　　过氧化物酶体增殖体激活受体(PPARs)是一种配体依赖性转录因子，属于核受体基因家族。PPARs包括PPARα，PPARβ和PPARγ三种亚型。最近人们发现 PPARα在肾脏疾病治疗中是一个新的靶点[1]。PPARα可通过对单核巨噬细胞的影响而发挥其强大的抗炎作用， 因此PPARα活性改变可能参与肾脏炎症反应过程[1]。贝特类药物可通过激活PPARα，调整其在肾脏的表达，从而降低肾血管性肾炎、肾血管性硬化症及糖尿病肾病等肾病的发生[1]。目前，有关贝特类药物对糖尿病肾病保护作用的研究还很少见。为进一步证实贝特类药物对糖尿病肾病的保护作用，我们拟观察非诺贝特(FB)对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及其分泌细胞外基质成分(IV型胶原、纤连蛋白)的影响，并同时检测其对转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2，9、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的影响，以探讨其作用机制，并为其进一步的临床应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　大鼠肾小球系膜细胞(MC)为武汉大学中国典型培养物保藏中心的大鼠肾小球系膜细胞EC(HBZY-1)，CCTCC编号：GDC124。非诺贝特(Fenofibrate，FB)购自徐州恩华药业集团有限责任公司(产品批号：20050501)。CCK-8试剂盒购购自日本同仁化学研究所，DMEM培养液为Gibco公司产品，胎牛血清为天津正江公司产品。分光光度仪为Backman DU460。酶标仪为美国Bio-tek Instruments ELX 800。IV型胶原(Col-IV)ELISA检测试剂盒、TIMP-1 ELISA检测试剂盒、TGF-β1 ELISA检测试剂盒购自美国Bionewtrans Pharm-aciutical Biotechnology公司，纤连蛋白(FN)ELISA检测试剂盒购自大连泛邦化工技术开发有限公司(日本进口分装)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MC培养：大鼠MC常规培养在含10%胎牛血清、葡萄糖浓度5.5 mmol·L-1的DMEM培养液中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养。2～3 d传代1次。

　　1.2.2 实验分组：①正常对照组(control group)：葡萄糖5.5 mmol·L-1;②高糖组(HG group)：葡萄糖25 mmol·L-1;③非诺贝特组(FB group)：非诺贝特100μmol·L-1+葡萄糖25 mmol·L-1。

　　1.2.3 系膜细胞增殖实验(CCK-8细胞计数法)： 将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化后配成2×107·L-1每孔100μL接种于96孔培养板， 贴壁后更换为1%血清的培养液(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)培养24 h，然后按实验分组换为不同的培养液，每组设8个复孔，分别于刺激的24、48及72 h后每孔加入10μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，应用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(A)。

　　1.2.4 ELISA法检测细胞培养液上清Col-IV，FN，TIMP-1及TGF-β1含量：系膜细胞接种在6孔板中，细胞培养贴壁生长至70%，更换为1%血清的培养液(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)同步培养24 h，按实验分组换为不同的培养液(1.5 mL)，分别于实验的24及48 h收集上清液，分装，-20 ℃保存，分别用于细胞培养液上清ELISA、明胶酶谱检测。

　　1.2.5 SDS-PAGE底物电泳明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2，9)活性：细胞培养及药物处理时间同1.2.4。分别配制5%层积胶和含1%明胶的7.5% SDS-PAGE分离胶，样本和6×SDS蛋白质上样缓冲液混合后不加热直接上样，进行不连续SDS-PAGE恒压电泳(160 V 40 mA，4 ℃)。电泳结束后，将凝胶置于2.5% Triton X-100溶液中室温摇洗2次，去除凝胶中的SDS。然后将凝胶加入反应液37 ℃孵育过夜。0.25%考马斯亮蓝R250染色4 h，脱色液脱色2 h。Image master系统凝胶照相后进行灰度分析以评估MMP-2及MMP-9的活性，结果采用TotalLab v1.11软件进行密度扫描分析。

　　1.3 统计学处理方法

　　组间差异用单因素方差分析，有显著差异者用LSD-t检验进行两两比较，组内不同时间比较用两样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 FB对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的影响

　　与对照组相比，24、48及72 h HG组的细胞存活都有显著增高，提示高糖可明显促进MC增殖。非诺贝特干预明显抑制高糖的促增殖作用，且与HG组比较差异均有显著性(24、48及72 h)(见表1)。

　　2.2 FB对高糖培养系膜细胞上清液中基质蛋白表达的影响

　　表2结果显示，与对照组比较，高糖刺激24 h与48 h可增加MC上清液中FN的合成。FB干预24 h与48 h后对高糖刺激的FN的合成都有明显的抑制作用，可接近对照组水平。与对照组相比，在实验24 h与48 h，高糖都可刺激MC上清液中Col-IV的合成。FB干预24 h对高糖刺激的Col-IV合成的抑制作用不明显，但干预48 h则对COL-IV合成有较明显的抑制作用。

　　2.3 FB对高糖培养系膜细胞上清液中TGF-β1及TIMP-1蛋白含量的影响

　　表3结果显示，与对照组比较，高糖在24 h和48 h都可刺激TGF-β1的合成;FB干预24 h及48 h后对高糖刺激的TGF-β1合成都有显著的抑制作用。与对照组相比，高糖在24 h和48 h都可刺激TIMP-1的合成;FB干预24 h及48 h后对高糖刺激的TIMP-1的合成有明显的抑制作用，可达接近对照组水平。

　　2.4 FB对高糖培养系膜细胞上清液中MMP-2及MMP-9活性活性的影响

　　见图1所示，明胶酶谱电泳后发现凝胶上出现3条透明条带，其中92 kD为MMP-9相应条带，72 kD为MMP-2酶原相应条带(pro-MMP-2)，64 kD为MMP-2活化形式相应的条带。MMP-2表达强于MMP-9，且MMP2以活性形式为主。表4结果显示，与对照组相比，24 h及48 h高糖刺激下上清液中MMP-2和MMP-9均显著减少，组内比较发现含量在各时间点变化不明显。FB干预24 h及48 h后MMP-2和MMP-9活性明显增强，但均未达到低糖组水平。

　　3 讨论

　　细胞外基质(ECM)代谢的失平衡(合成增多，降解减少)是糖尿病肾病(DN)形成的关键性因素。Col-IV与FN是构成ECM的主要结构蛋白。我们发现高糖培养可明显促进MC增殖，并对系膜细胞分泌Col-IV和FN有显著的促进作用，这一点同诸多报道一致[2-3]。基质金属蛋白酶(MMPs)是ECM主要的降解酶之一，其中起作用的主要是MMP-2及MMP-9。基质金属蛋白酶抑制剂是MMPs天然的特异性抑制因子，在肾脏中起作用的主要为TIMP-1。我们的研究发现高糖刺激会促使系膜细胞MMP-2及MMP-9表达显著下降，而TIMP-1表达升高。这揭示了高糖不仅可以通过下调MMPs的基因表达而减少其对ECM的降解，同时可通过增加TIMP-1表达而抑制MMPs酶的活性，最终加速FN、Col-IV等细胞外基质的沉积。TGF-β1既可刺激ECM蛋白质合成，又可降低ECM降解酶的活性，从而引起基质蛋白沉积。近年来，TGF-β1已被认为是MMPs/TIMP系统最重要的调控因子[4]。本研究发现高糖在导致ECM分泌增加、MMPs/TIMP系统的紊乱同时，也引起TGF-β1蛋白分泌的增加，因此ECM的累积及降解减少可能与TGF-β1介导有关。

　　贝特类降脂药物是最先发现的PPARα合成配体，目前临床使用的有氯贝特、苯扎贝特及FB等。此外，除了对脂代谢的影响外，尚可起到抗炎及抗动脉硬化的作用[5]。Park等[6]报道16周PPARα基因敲除的糖尿病小鼠较野生型糖尿病小鼠有着更为严重的微量白蛋白尿、肾小球硬化及系膜基质的扩张;体外研究还显示FB可明显下调高糖培养肾小球系膜细胞Col-IV及TGF-β1的合成。Park等[7]还发现FB能显著改善db/db小鼠的高血糖、胰岛素抵抗、尿微量白蛋白及肾小球纤维化。Chen等[8]报道FB通过下调TGF-β1及纤溶酶原激活物抑制物-1的表达而显著改善STZ诱导的Wistar大鼠糖尿病肾病的进展。也有临床研究表明，FB治疗3年可显著减少2型糖尿病患者微量白蛋白尿的进展[9]。我们的研究表明，FB干预除了能明显减少高糖培养的系膜细胞Col-IV，FN的合成外，还可上调MMP-2及MMP-9的表达及减少TIMP-1的分泌，从使MMPs/TIMP-1比值升高，说明了FB干预确实能有效减轻ECM的积聚，延缓肾小球硬化。同时我们也发现FB能显著降低促纤维化因子TGF-β1的表达，提示了FB对MMPs/TIMP系统的影响可能部分是通过阻断TGF-β1来介导的。

　　【参考文献】

　　[1]Varghese Z, Moorhead JF, Ruan XZ. The PPARalpha ligandfenofibrate: meeting multiple targets in diabetic nephropa-thy [J]. Kidney Int, 2006, 69(9): 1511-1517.

　　[2]Koya D, Haneda M, Nakagawa H, et al. Amelioration ofaccelerated diabetic mesangial expansion by treatment witha PKC beta inhibitor in diabetic db/db mice, a rodent modelfor type 2 diabetes[J]. FASEB J, 2000, 14(3): 439-447.

　　[3]Park IS, Kiyomoto H, Abboud SL, et al. Expression of trans-forming growth factor-beta and type IV collagen in earlytreptozotocin-induced diabetes [J]. Diabetes, 1997, 46(3):473-480.

　　[4]Border WA, Noble NA. Evidence that TGF-beta should be atherapeutic target in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int,1998,54(4):1390-1391.

　　[5]Staels B, Fruchart JC. Therapeutic roles of peroxisomeproliferator-activated receptor agonists [J]. Diabetes, 2005,54:2460-2470.

　　[6]Park CW, Kim HW, Ko SH, et al. Accelerated diabetic neph-ropathy in mice lacking the peroxisome proliferator-acti-vated receptor alpha [J]. Diabetes, 2006, 55(4):885-893.

　　[7]Park CW, Zhang Y, Zhang X, et al. PPARalpha agonistfenofibrate improves diabetic nephropathy in db/db mice[J]. Kidney Int, 2006, 69(9):1490-1491.

　　[8]Chen LL, Zhang JY, Wang BP. Renoprotective effects offenofibrate in diabetic rats are achieved by suppressing kid-ney plasminogen activator inhibitor-1 [J]. Vascul Pharmacol,2006, 44(5):309-315 .

　　[9]Ansquer JC, Foucher C, Rattier S, et al. Fenofibrate reducesprogression to microalbuminuria over 3 years in a placebo-controlled study in type 2 diabetes: results from the Diabe-tes Atherosclerosis Intervention Study (DAIS) [J]. Am JKidney Dis, 2005, 45(3): 485-493.