AT2对成年压力超负荷性肥大心肌细胞TNFα、IL1β及IL6分泌的调控

作者：周娟，徐心，刘进军，林元喜，高广道作者单位：西安交通大学医学院：生理学与病理生理学系，陕西西安 710061；第二附属医院普外科，陕西西安 710004【摘要】  目的 观察AT2对肥大心肌细胞炎症因子合成的调控作用及AT1和AT2间的相互关系。方法 采用腹主动脉缩窄法构建SD大鼠压力超负荷性心肌肥大模型。选用术后8周肥大的心肌细胞，将其分为AngⅡ组、AngⅡ+losartan组、AngⅡ+PD123319及AngⅡ+losartan+PD123319组。待实验结束，RTPCR法检测细胞TNFα、IL1β及IL6的mRNA表达水平，放免法检测TNFα、IL1β及IL6的蛋白表达。结果 与AngⅡ组相比，AT1拮抗剂losartan不影响TNFα和IL1β的mRNA及蛋白表达。单独应用AT2拮抗剂PD123319及联合应用losartan和PD123319均可使TNFα和IL1β的mRNA及蛋白表达水平下调。联合应用二者TNFα和IL1β mRNA的表达水平介于单独应用losartan和PD123319组之间。与AngⅡ单独联用losartan或PD123319相比，同时联用二者可使IL6 mRNA的表达水平上调。结论 AT2参与了肥大心肌细胞炎症因子的表达调控。AT1与AT2之间并非简单的拮抗关系。 【关键词】  心肌细胞；血管紧张素Ⅱ二型受体；肿瘤坏死因子α；白介素1β；白介素6基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30271435)　　Regulation of AT2 on TNFα, IL1β and IL6 synthesis of　adult hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload　　Zhou Juan, Xu Xin, Liu Jinjun, Lin Yuanxi, Gao Guangdao　　(Department of Physiology and Pathophysiology, Medical School of Xian Jiaotong University,Xian 710061; Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the role of AT2 in inflammatory factor synthesis of adult hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload and the relationship between AT1 and AT2. Methods  The left ventricular hypertrophy induced by pressure overload was achieved by placing a band around the abdominal aorta. We isolated and purified hypertrophic cardiomyocytes at 8 weeks after operation. The cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups: AngⅡ, AngⅡ+losartan, AngⅡ+PD123319 and AngⅡ+losartan+PD123319 groups. The mRNA levels of TNFα, IL1β and IL6 were detected by RTPCR and the protein expression of TNFα, IL1β and IL6 in medium were detected by radioimmunoassay. Results  Compared with that of the AngⅡgroup, losartan could not influence the mRNA and protein expression of TNFα and IL1β, but PD123319 decreased them severely. The mRNA and protein expression of TNFα and IL1β also decreased with losartan and PD123319 treatment, but they were higher than in PD123319 alone treatment group. Compared with the AngⅡ, AngⅡ+losartan and AngⅡ+PD123319 groups, the IL6 mRNA increased when cells were treated with losartan and PD123319 simultaneously. Conclusion  AT2 can regulate the expression of inflammatory factors of hypertrophic cardiomyocytes. The relationship between AT1 and AT2 is not only antagonistic.

　　KEY WORDS: cardiomyocyte; angiotensinⅡreceptor 2 (AT2); TNFα; IL1β; IL6

　　作为心血管系统关键性调控因子的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)在心肌中主要有Ⅰ型受体(AT1)和Ⅱ型受体(AT2)。已证实，AT1可介导心肌细胞肥大、成纤维细胞的增殖以及胶原的合成，从而诱发心肌重构，而AT2的功能至今尚不完全清楚。大多学者认为AT2可以拮抗AT1的效应，但近来也有研究结果与此相异[12]。

研究提示，在多种心脏疾病中表达增多的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNFα)、白介素1β(interleukin1β, IL1β)及白介素6(interleukin6, IL6)[3]等在疾病的发生发展中均具有广泛的病理生理作用。TNFα、IL1β及IL6[4]均可以引起明显的细胞肥大效应：暴露于IL1β和IL6的心肌细胞不仅蛋白质合成增加，一些胎儿期基因，如心房利钠多肽(atrial natriuretic peptide, ANP)及β肌球蛋白重链(βmyosin heavy chain, βMHC)的表达也明显增加[56]；心脏过表达TNFα的转基因小鼠不仅存在心肌细胞的肥大和功能异常，其心力衰竭和死亡的发生率也明显增加[7]。此外，IL6及TNFα等还具有明显的负性肌力作用，从而抑制心脏的收缩功能；慢性心力衰竭患者体内IL1β和TNFα含量的升高与室壁应力增加间的相互作用，共同参与了疾病的发生[8]。   　　AngⅡ及其两型受体在肥大的心肌细胞中的相互作用以及其对细胞因子表达及释放的影响目前还较少涉及。因此，本实验以压力超负荷性肥大心肌细胞为研究对象，探讨AT1和AT2对肥大心肌细胞炎性细胞因子表达的调控作用，同时观察AT1与AT2之间的相互关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  雄性SD大鼠，体重220-250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2  药品及试剂  AngⅡ、PD123319、洛沙坦(losartan)、Ⅰ型胶原酶(collagenaseⅠ)、Ⅱ型胶原酶(collagenaseⅡ)及牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为Sigma公司产品；M199培养基为GIBCO公司产品；Trizol 及Taq酶为Promega公司产品；dNTPs及100bp DNA Ladder为华美生物工程公司产品；引物由上海康成生物技术有限公司合成；放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。

　　1.3  压力超负荷性心肌肥大模型的构建  将实验动物随机分为2组：腹主动脉缩窄(aortaconstriction, AC)组，于左肾动脉上方小心分离长约3mm的腹主动脉，套以内径为0.8mm的银夹造成缩窄；假手术(shamoperation, SO)组，除不以银夹缩窄腹主动脉外，其余操作同AC组。手术后饲养8周处死取材。

　　1.4  心肌肥大指数测定  测取左心室湿重(包括左心室游离壁和室间隔)，计算左心室重与体重比值(left ventricle/body weight ratio, LV/Bwt)作为心肌肥大指标。作HE染色切片，使用目镜测微尺测量心肌细胞横径(left ventricular cardiomyocytes transection diameter, LVTDM)。高倍镜下(10×40)随机选取20个横纹清晰、胞核完整、形状规则的心肌细胞，测其横径，取其均值作为心肌肥大另一指标。

　　1.5  心肌细胞的分离及培养  采用胶原酶Langendorff灌流法获取所需手术组肥大心肌细胞。并将分离所得心肌细胞置于含有2g/L BSA、5mmol/L肌酸、5mmol/L牛璜酸、2mmol/L肉毒碱、100u/mL胰岛素、100u/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的M199培养基中培养。细胞随机分为：①AngⅡ组(终浓度10-6mol/L)；②AngⅡ+AT1受体拮抗剂losartan组(用终浓度10-5mol/L的losartan预处理1h后加入AngⅡ)；③AngⅡ+AT2受体拮抗剂PD123319组(用终浓度10-5mol/L的PD123319预处理1h后加入AngⅡ)；④AngⅡ+losartan+PD123319组(用losartan和PD123319同时预处理1h后加入AngⅡ)。处理因素作用24h后，RTPCR检测细胞TNFα、IL1β及IL6的mRNA水平；另培养的肥大心肌细胞同样分组干预36h后收集培养液上清，放免法检测其中TNFα、IL1β及IL6的蛋白表达水平。

　　1.6  RTPCR  一步法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增。条件为：94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，于72℃再延伸5min。引物序列、产物长度及退火温度见表1。以βactin作为内参照，用三者凝胶成像后的灰度值与βactin相比，代表三者的相对表达水平。

1.7  放射免疫检测分析  按放免试剂盒操作步骤进行。

　　1.8  统计学分析  数据以±s表示，SPSS12.0统计分析软件，各组间相互比较分析采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  模型构建及结果  缩窄大鼠腹主动脉8周后，左心室重/体重比值明显增大，HE染色切片显示模型组左室心肌细胞横径增加，提示心肌细胞明显肥大(表2)。

　　表1  RTPCR引物序列、退火温度及产物长度（略）

　　Table 1  Sequence, expected fragment size and annealing temperature of each PCR primer and product

　　表2  左心室重/体重比和心肌细胞横径（略）

　　Table 2  The LV/Bwt and LVTDM(n=8)

　　*P<0.05 vs. SO group. SO: shamoperation; AC: aortaconstriction; LVTDM: left ventricular cardiomyocytes transection diameter; LV/Bwt: left ventricle/ body weight ratio

　　2.2  AT1和AT2对压力超负荷性肥大心肌细胞TNFα、IL1β及IL6表达的调控  在mRNA水平上与AngⅡ组相比，AT1拮抗剂losartan不影响AngⅡ诱导的肥大心肌细胞TNFα和IL1β的表达，而AT2拮抗剂PD123319可显著下调二者的表达。同时应用losartan和PD123319也可使AngⅡ诱导的肥大心肌细胞TNFα和IL1β的表达下调，但其水平介于单独应用losartan和单独应用PD123319之间。与AngⅡ组相比，单独联用losartan或PD123319均不影响肥大心肌细胞IL6的表达。但较AngⅡ组、单独应用losartan或PD123319组，同时应用二者却可使IL6的mRNA表达水平显著升高(表3、图1-3)。

　　表3  肥大心肌细胞中TNFα、IL1β及IL6 mRNA的表达（略）

　　Table 3  The mRNA expression of TNFα, IL1β and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes

　　*P<0.05 vs. AngⅡgroup; #P<0.05 vs. AngⅡ+losartan group; △P<0.05 vs. AngⅡ+PD123319

　　图1  压力超负荷性肥大心肌细胞中TNFα mRNA的表达（略）

　　Fig.1 Expression of TNFα mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload

　　M: marker; A: AngⅡ; B:AngⅡ+losartan;C: AngⅡ+PD123319; D: AngⅡ+losartan+PD123319

　　图2  压力超负荷性肥大心肌细胞中IL1β mRNA的表达（略）

　　Fig.2 Expression of IL1β mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload

　　M: marker; A: AngⅡ; B:AngⅡ+losartan;C: AngⅡ+PD123319; D: AngⅡ+losartan+PD123319

　　图3  压力超负荷性肥大心肌细胞中IL6 mRNA的表达（略）

　　Fig.3 Expression of IL6 mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload

　　M: marker; A: AngⅡ; B:AngⅡ+losartan;C: AngⅡ+PD123319; D: AngⅡ+losartan+PD123319  

　　在蛋白质水平上，与AngⅡ组相比，losartan不影响肥大心肌细胞TNFα和IL1β的表达，单独联用PD123319或与losartan合用均可使TNFα和IL1β的表达下调。联合联用二者与单独联用losartan组相比，IL1β的表达也有所下调。    　　因培养液上清中IL6的含量过低，实验中采用的方法未能检出。因此，以上mRNA水平上IL6的相关结果，在蛋白水平上未观察到(表4)。

　　表4  放免法测定肥大心肌细胞中TNFα、IL1β及IL6的蛋白表达（略）

　　Table 4  The protein expression of TNFα, IL1β and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes

　　*P<0.05 vs. AngⅡgroup; #P<0.05 vs. AngⅡ+losartan group

　　3  讨论

经腹主动脉缩窄8周，SD大鼠左心室重/体重比值明显增大，左室心肌细胞横径增加约45%，表明我们获得的确为肥大心肌细胞。有资料表明，AngⅡ可以促进正常心肌细胞合成TNFα，且用losartan预处理可明显减少培养液中的TNFα含量[9]，说明此过程由AT1介导。但本实验结果显示，阻断AT1并不能显著影响压力超负荷性肥大心肌细胞TNFα的表达，而AT2拮抗剂PD123319却可以显著下调TNFα mRNA及蛋白表达水平。同时，也对在心肌重塑中同样起重要作用的IL1β和IL6进行了观察。结果表明：在压力超负荷性肥大心肌细胞中对IL1β起主要调控作用的仍为AT2，阻断AT2可使其表达明显下调。因细胞培养上清液中浓度过低，我们未能检测出各组培养液中IL6的蛋白表达水平。而有关AT2受体通过激活NFκB通路参与组织和器官炎症过程的现象，在肾脏和血管平滑肌细胞中也已经得到了证实。分析实验结果可能由于：①其他学者的研究对象多为新生大鼠心肌细胞，而已知新生大鼠与成年大鼠心肌细胞表型的特性存在着明显的差异，建立在新生大鼠心肌细胞的实验结果不能完全等同于成年大鼠心肌细胞；②正常与压力超负荷性肥大心肌细胞表面AT1与AT2受体的表达量明显不同，而且压力超负荷性肥大心肌细胞本身已存在明显的形态和基因改变，因而建立在正常大鼠心肌细胞上的实验结果也不能完全等同于已经发生肥大的心肌细胞。    　　目前大多研究者认为AT2可以对抗AT1介导的心肌细胞生长效应[1011]，且阻断AT1抑制细胞肥大过程至少有部分是通过同时活化的AT2介导的[12]。然而，也有实验结果显示二者之间也可能存在着协同关系：Ryckwaert等采用成年雄性Wistar大鼠研究心脏AT2与AT1在缺血再灌注中的作用。结果表明AT2与AT1的作用具有累积效应，因为同时阻断两种受体比单纯阻断任何一种受体都更能促进心功能的恢复[1]；另一研究小组的实验结果也证实：联合应用losartan 和PD123319较之单独应用任一拮抗剂都更能降低胰岛素引起的低血糖大鼠血浆中肾上腺素的浓度[2]。    　　而本实验结果则提示AT2与AT1之间的关系较为复杂。在mRNA水平上，与AngⅡ组相比，单独联用PD123319虽可明显下调TNFα及IL1β的表达，但同时联合应用losartan 和PD123319却使下调的mRNA有所上升，提示在对压力超负荷性肥大心肌细胞TNFα及IL1βmRNA的表达调控中AT1与AT2之间可能存在拮抗关系。同样，在mRNA水平上，与AngⅡ组相比，单独联用losartan或PD123319均不能显著影响IL6的表达，但同时联合应用losartan和PD123319却可使其表达水平升高，提示在对压力超负荷性肥大心肌细胞IL6 mRNA的表达调控上AT1与AT2之间可能存在着协同关系。由于蛋白质的表达还存在转录后翻译等多个环节，因而其差异不如mRNA水平上的结果显著。因此，相比之下mRNA水平上的结果可以更为清楚的阐明压力超负荷性肥大心肌细胞中AT2与AT1之间的相互关系。而有关AT2在心肌重塑中的作用还有待于进一步的深入研究。    　　总之，本实验结果表明，AT2参与了压力超负荷性肥大心肌细胞中细胞因子TNFα、IL1β及IL6表达的调控。AT2与AT1之间的关系较为复杂，二者之间并不是简单的拮抗关系。

【参考文献】  　　[1]Ryckwaert F, Colson P, Guillon G, et al. Cumulative effects of AT1 and AT2 receptor blockade on ischaemiareperfusion recovery in rat hearts [J]. Pharmacol Res, 2005, 51(6):497502.

　　[2]Worck RH, Frandsen E, Ibsen H, et al. AT1 and AT2 receptor blockade and epinephrine release during insulininduced hypoglycemia [J]. Hypertension, 1998, 31(1 Pt 2):384390.

　　[3]程翔，廖玉华，李彬, 等. 早期美托洛尔治疗对急性心肌梗死大鼠心肌炎症因子表达和心功能的影响 [J]. 中华心血管病杂志, 2005, 33(5):448452.

4]Tanaka T, Kanda T, Takahashi T, et al. Interleukin6induced reciprocal expression of SERCA and natriuretic peptides mRNA in cultured rat ventricular myocytes [J]. J Int Med Res, 2004, 32(1):5761.

　　[5]Ng DC, Long CS, Bogoyevitch MA. A role for the extracellular signalregulated kinase and p38 mitogenactivated protein kinases in interleukin1 betastimulated delayed signal tranducer and activator of transcription 3 activation, atrial natriuretic factor expression, and cardiac myocyte morphology [J]. J Biol Chem, 2001, 276(31):2949029498.

　　[6]Tanaka T, Kanda T, Itoh T, et al. Increased cardiac weight in interleukin6 transgenic mice with viral infection accompanies impaired expression of natriuretic peptide genes [J]. Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 2001, 110(56):275283.

　　[7]Janczewski AM, Kadokami T, Lemster B, et al. Morphological and functional changes in cardiac myocytes isolated from mice overexpressing TNFalpha [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 284(3):H960H969.

　　[8]杨建峰，魏经汉，董建增，等. 慢性心力衰竭患者血清IL1β、TNFα水平与左室平均室壁应力测定 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(5):892894.

　　[9]Frolkis I, Gurevitch J, Yuhas Y, et al. Interaction between paracrine tumor necrosis factoralpha and paracrine angiotensin II during myocardial ischemia [J]. J Am Coll Cardiol, 2001, 37(1):316322.

　　[10]Wollert KC, Drexler H. The reninangiotensin system and experimental heart failure [J]. Cardiovasc Res, 1999, 43(4):838849.

　　[11]Booz GW, Baker KM. Role of type 1 and type 2 angiotensin receptors in angiotensin IIinduced cardiomyocyte hypertrophy [J]. Hypertension, 1996, 28(4):635640.

　　[12]Xu J, Carretero OA, Liu YH, et al. Role of AT2 receptors in the cardioprotective effect of AT1 antagonists in mice [J]. Hypertension, 2002, 40(3):244250.