Ghrelin基因Arg51Gln多态性与西安汉族2型糖尿病、高血压病的相关性

作者：谢璇，张静，王玉环，张春虹，王俊宏，袁晓红，倪红燕作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院内分泌科，陕西西安 710004 【摘要】  目的 研究ghrelin基因Arg51Gln多态性在中国西安汉族人群的分布情况，并探讨该多态性与2型糖尿病、高血压病发病的相关性。方法 应用PCR限制性片段长度多态性法分析中国西安地区汉族人305例(正常对照组80例；2型糖尿病组125例；高血压病组48例；2型糖尿病合并高血压病组52例)Ghrelin基因Arg51Gln多态性的分布及其与临床指标间的相关性。结果 2型糖尿病组、高血压病组、2型糖尿病合并高血压病组的基因型频率分别与正常对照组相比，均无统计学意义(P值分别为：0.652、0.201、0.212)；等位基因分布分别与正常对照比较无统计学意义(P值分别为：1.002、0.199、0.124)；2型糖尿病组Gln51等位基因携带者的BMI、FINS、HOMAIR均高于野生型(P值分别为：0.045、0.003、0.041)。结论 该基因多态性与2型糖尿病胰岛素抵抗相关，Ghrelin基因Arg51Gln多态性与高血压病无相关性。 【关键词】  Ghrelin；多态性；单核苷酸；2型糖尿病；高血压基金项目：陕西省科技攻关基金资助项目(2002K10G4)　　Relationship between polymorphism of Ghrelin and type 2 diabetes　in the Chinese Han population in Xian City　　Xie Xuan, Zhang Jing, Wang Yuhuan, Zhang Chunhong, Wang Junhong, Yuan Xiaohong, Ni Hongyan　　(Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China) 　　ABSTRACT: Objective  To investigate the distribution of Ghrelin gene Arg51Gln polymorphism from Chinese Han population in Xian City and its association with type 2 diabetes mellitus or hypertension. Methods  Ghrelin gene polymorphism was assayed by PCRRFLP in 305 Chinese Han subjects. Among them, there were 80 in normal control group, 125 in type 2 diabetes group, 48 in hypertension group, and 52 in type 2 diabetes+hypertension group. The relationship with clinical indexes was analyzed. Results  The allele frequency and genotypes in type 2 diabetes group, hypertention group and type 2 diabetes+hypertention group were not significantly different from those in normal group (P=0.652, 0.201, 0.212). In the type 2 diabetes patients, BMI, FINS and HOMAIR of the Gln51 carriers were significantly higher than those with the wild genotype (P=0.045, 0.003, 0.041). Conclusion  The results suggested that polymorphism was associated with insulin resistance of type 2 diabetes. Arg51Gln polymorphism in the Ghrelin gene was not associated with hypertension.　　KEY WORDS: Ghrelin; polymorphism; single nucleotide; type 2 diabetes mellitus; hypertension　　Ghrelin是近年来发现的一种内源性生长激素促分泌剂受体的配体。Ghrelin不仅能促进生长激素的分泌，还能增加体重及调节能量代谢。新近研究发现，Ghrelin与胰岛素及糖脂代谢密切相关，低Ghrelin水平可以作为2型糖尿病和糖耐量减低的一个危险因子[1]。有研究发现Ghrelin基因Arg51Gln多态性与2型糖尿病及高血压的发生有关[2]，但不同地域、不同人种的研究结果不尽相同[24]。本研究通过检测位于Ghrelin基因2号外显子的Arg51Gln位点多态性，以探讨其与2型糖尿病及高血压病的相关性。　　1  对象和方法　　1.1  对象  所有受试者均为汉族，来自西安地区，彼此间无血缘关系。高血压患者符合1999年世界卫生组织/国际高血压联盟(WHOISH)高血压治疗指南中的高血压诊断标准；糖尿病患者符合1999年WHO推荐的糖尿病诊断标准。将受试者分为4组：正常对照组(normal group)，为2006年4月-2006年12月在西安交通大学医学院第二附属医院体检的健康成人(明确排除高血压病、2型糖尿病及其他内分泌代谢疾病病史)共80例，其中男48例，女32例，平均年龄(50.04±10.44)岁；2型糖尿病组(type 2 diabetes group, T2DM)为同期病房及门诊新诊断或已明确诊断后的2型糖尿病患者125例，排除其他内分泌代谢疾病，其中男69例，女56例，平均年龄(50.26±9.64)岁；高血压组(hypertension group, HT)为同期病房及门诊新诊断或已明确诊断后的原发性高血压48例，其中男31例，女17例，平均年龄(52.91±12.21)岁；2型糖尿病合并高血压组(type 2 diabetes+hypertension group, HT+T2DM)为同期病房及门诊新诊断或已明确诊断后的2型糖尿病合并高血压患者，共52例，其中男24例，女28例，平均年龄(51.5±10.14)岁。

　1.2  方法　　1.2.1  收集资料  询问受试者病史，并测量体重、身高、腰围、臀围、血压，计算体重指数(BMI)和腰臀比(WHR)。

　　1.2.2  标本采集  空腹静脉血5mL，其中3mL用于生化指标测定，2mL用于糖化血红蛋白测定后(-20℃，保存)以TKM法提取基因组DNA[4]。计算HOMAIR(胰岛素抵抗指数)=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

　　1.2.3  Ghrelin基因Arg51Gln位点多态性分析  查阅相关文献及与GenBank核对序列设计引物，引物序列为：上游引物：5 TGA CCT CAC TGT TTC TGG AAG 3，下游引物：5 GGA CCC TGT TCA CTG CCA C 3(由北京奥科生物技术有限公司合成)。以50-200ng DNA为模板进行PCR扩增。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，63.8℃退火30s，72℃延伸45s，共33个循环，72℃终末延伸10min。PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶确认后，继以SacⅠ限制性内切酶(宝生物工程大连有限公司)酶切，37℃孵育4h或过夜，于含0.5mg/L EB的20g/L(2%)琼脂糖凝胶上4V/cm电泳1h左右，紫外灯下观测基因型。

　　1.2.4  统计学处理  计算HardyWeinberg平衡以判断样本的代表性。用SPSS11.5统计软件包进行分析。所有计量资料均运用分位数图(quantilequantile plot，QQ plot)法进行正态性检验后，正态分布资料采用(±s)表示，组间比较单因素F检验。偏态分布资料如Fins、HOMAIR取自然对数转换成正态分布后进行比较。计数资料用频数表示，组间比较采用χ2检验或χ2检验Fisher精确概率法。

　　2  结果

　　2.1  临床资料比较  各组患者的年龄，性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。

　　表1  各组基本资料的比较（略）

　　Table 1  Comparison of basic data of groups

　　*P<0.05, **P<0.01, vs. normal; HT: hypertension; T2DM: type 2 diabetes

　　2.2  Ghrelin基因的酶切产物  Ghrelin基因PCR产物为278bp，可被酶解为两个片段162bp带及116bp带。Gln纯合子(GG)电泳带型仅278bp带；Arg纯合子(AA)电泳带型为162bp带及116bp带；Arg/Gln杂合子(AG)电泳带型为278bp带、162bp带及116bp带(图1)。

　　2.3  Ghrelin基因型和等位基因频率在各组中的分布  Ghrelin基因型和等位基因频率在各组中的分布均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。病例各组分别与正常对照组基因型比较，差异无统计学意义(P均>0.05)。病例各组等位基因频率分别与正常对照组的比较，差异仍无统计学意义(P均>0.05，表2)。

　　2.4  各组临床资料与Ghrelin基因变异的关系  由于本研究中Gln/Gln基因型罕见(仅有1例)，样本例数太少，单独进行分析容易产生误差，故将其与Arg/Gln基因型组合并作为一组，进行比较。    　　2型糖尿病组Gln51等位基因携带者的BMI、FINS、2hINS、HOMAIR均高于野生型(P<0.05)，HDLC、Apoa均低于野生型(P<0.05)，其余指标无统计学意义(P>0.05，表2)；高血压病组Arg51Gln基因型携带者的HDLC低于野生型(0.96±0.17 vs. 1.20±0.25，P<0.05)，其余各指标间差异无统计学意义(P>0.05)；2型糖尿病合并高血压病组Gln51等位基因携带者的DBP高于野生型(97.50±2.61 vs. 91.33±13.57，P<0.05)，HDLC、Apoa均低于野生型(0.53±0.31 vs. 0.99±0.31，0.70±0.26 vs. 1.03±0.26，P<0.05)，其余指标无统计学意义(P>0.05，表3)。

　　图1  Ghrelin基因Arg51Gln的多态性RFLP分析（略）

　　Fig.1 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the Arg51Gln in the ghrelin gene

　　M: FX174HaeⅢ digest DNA marker; 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 lane: wildtype homozygotes; 6 lane: mutated homozygotes; 9 lane: heterozygotes

表2  各组基因频率和基因型的频率分布（略）

　　Tabel 2  Distribution of genotype and allele frequency

　　HT: hypertension; T2DM: type 2 diabetes    　　表3  糖尿病组各基因型临床资料的比较（略）

　　Table 3  Relationship between the clinical variables and genotype of Ghrelin gene Arg51Gln mutation in type 2 diabetes group

　　*P<0.05, vs. normal　　　　3  讨论

　　3.1  Ghrelin基因Arg51Gln的突变率  本研究检测了305例中国西安地区汉族正常人、2型糖尿病及高血压病患者的Ghrelin基因Arg51Gln位点多态性，共发现11例杂合子(Arg/Gln)、1例纯合子(Gln/Gln)，其余293例为野生型(Arg/Arg)，显示在中国西安地区人群存在该位点变异。在健康人群中未发现Gln/Gln纯合子，其Gln51等位基因频率为1.2%，与芬兰人(2%)[1]、瑞典人(1.62%)[3]接近，比丹麦高加索人(0.45%)[4]、印第安纳白人(0.8%)[3]高。该位点多态性在意大利人[5]和印第安纳黑人[3]中没有发现。这些研究结果间的差异可能与个体异质性、种族和样本量有关。

　　3.2  Ghrelin基因Arg51Gln与糖尿病  多个研究表明低Ghrelin水平与HOMAIR呈负相关[1，68]。Poykko等[5]研究表明2型糖尿病患者呈低Ghrelin水平且Ghrelin水平与胰岛素抵抗独立相关。已有研究发现Gln等位基因携带者具有低Ghrelin水平[1]，Ghrelin序列中51位的精氨酸是内源性蛋白水解酶的作用位点，蛋白水解酶切除含66个氨基酸的羧基末端后可形成成熟的Ghrelin，而当51位的精氨酸突变为谷氨酰胺时则影响了蛋白水解酶对该位点的识别，从而不能形成成熟Ghrelin[8]。本研究结果显示，在2型糖尿病组Gln51等位基因携带者的FINS、2hINS、HOMAIR均高于野生型(P分别为0.003、0.015、0.041)，提示2型糖尿病胰岛素抵抗与Ghrelin基因突变相关。Nanette等[9]报道美国宾夕法尼亚州患代谢综合症的安曼派教徒的OGTT血糖水平、胰岛素分泌、HOMAIR在Ghrelin基因Arg51Gln不同基因型人群中比较，无统计学差异。与本研究结果不一致可能与种族差异、基因突变对表型表达的作用程度有关。关于Ghrelin基因突变与胰岛素抵抗的相互关系，尚需进一步研究。    　　关于Ghrelin基因Arg51Gln位点多态性与糖尿病相关性研究，芬兰Poykko[1]在研究高加索人群Ghrelin基因Arg51Gln与2型糖尿病关系时发现：Gln51等位基因频率(4.8%)几乎是非糖尿病患者(2%)的3倍。Ghrelin基因Arg51Gln突变是2型糖尿病的危险因素(OR=2.53，CI：1.11-5.75，P=0.027)。而丹麦Lesli等[3]研究高加索人的Ghrelin前体基因突变与肥胖和糖尿病相关性时，发现51Gln等位基因频率为0.85%，与糖尿病及糖代谢无关，与本研究结果相同：西安地区2型糖尿病组Ghrelin基因Gln等位基因的频率为0.8%，与正常对照组(1.2%)相比，Gln等位基因的频率差异无统计学意义(P=1.002)；2种基因型的分布在2型糖尿病组与正常对照组之间亦无统计学意义(P＝0.652)，但尚不能排除突变的Gln51基因型与2型糖尿病相关。其依据是：①本实验2型糖尿病组Gln51等位基因携带者的BMI、FINS、2hINS、HOMAIR均高于野生型，提示Gln51基因携带者存在胰岛素抵抗。Poykko[1]研究表明Gln等位基因携带者具有低Ghrelin水平。而低Ghrelin水平与胰岛素抵抗和2型糖尿病独立相关[1,57]。②2型糖尿病属于复杂性状遗传疾病，涉及多个基因，每个基因对疾病作用程度不等。Ghrelin基因可能不是导致糖尿病的主效基因。

　　3.3  Ghrelin基因Arg51Gln与高血压  有学者在研究Ghrelin基因Arg51Gln与高血压关系时发现：51Gln等位基因是高血压的危险因子(OR=2.63，CI：1.37-5.08，P=0.003)[1]。Ursula等[10]通过连续4年测量血压变化，筛查Ghrelin基因6个多态性位点，发现在Arg51Gln位点与血压或高血压均无相关性。与Ursula的研究结果近似，本研究高血压病组Gln51等位基因频率(4.2%)虽比正常对照组(1.2%)高，但差异无统计学意义(P=0.199)，提示Arg51Gln突变可能与西安地区汉族人群高血压无相关性。本实验结果与Poykko[1]的结果不同，推测高血压是复杂遗传性状的多基因遗传疾病之一，基因与环境因素相互作用，环境因素在其发生发展过程中的作用十分重要。

综上所述，中国西安地区人群存在该基因Arg51Gln位点变异。Ghrelin基因Gln51基因突变与2型糖尿病胰岛素抵抗相关，但Ghrelin基因可能并非是中国西安汉族2型糖尿病的主效基因。高血压病与Ghrelin基因Arg51Gln多态性无相关性。考虑样本量的影响，本结论仍需大样本量研究证实。

【参考文献】  　　[1]Poykko S, Ukkola O, Kauma H, et al. Ghrelin Arg51Gln mutation is a risk factor for type 2 diabetes and hypertension in a random sample of middleaged subjects [J]. Diabetologia, 2003, 46(4):455458.

　　[2]Ukkola O, Ravussin E, Jacobson P, et al. Role of Ghrelin polymorphisms in obesity based on three different studies [J]. Obesity Research, 2002, 10(8):782789.

　　[3]Lesli H, Larsenab T, Anette P, et al. Mutation analysis of the prepro Ghrelin gene: No association with obesity and type 2 diabetes [J]. Clin Biochem, 2005, 38:420424.

　　[4]赵嘉惠，张华屏. 外周血DNA提取方法的比较及改良 [J]. 山西医科大学学报, 2006, 37(1):1213.

　　[5]Poykko SM, Kellokoski E, Horkko S, et al. Low plasma Ghrelin is associated with insulin resistance, hypertension, and the prevalence of type 2 diabetes [J]. Diabetes, 2003, 52:25462553.　　　　[6]Nakazato M, Murakami N, Date Y, et al. A role for Ghrelin in the central regulation of feeding [J]. Nature, 2001, 409:194198.

　　[7]Marchesini G, Pagotto U, Bugianesi E, et al. Low Ghrelin concentrations in nonalcoholic fatty liver disease are related to insulin resistance [J]. Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(12):56745679.

　　[8]Ukkola O, Ravussin E, Jacobson P, et al. Mutations in the preproghrelin/ghrelin gene associated with obesity in humans [J]. Clin Endocrinol Metab, 2001, 86:39963999.

　　[9]Nanette IS, Toni I, Pollin J, et al. Variants in the ghrelin gene are associated with metabolic syndrome in the old order Amish [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(12):66726677.

　　[10]Ursula M, Marjukka K, Jaana L, et al. Association between ghrelin gene variations and blood pressure in subjects with impaired glucose tolerance [J]. Am J Hypertens, 2006, 19:920926.