Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响

　　作者：张颖 肖谦 作者单位：重庆医科大学附属第一医院老年科内分泌组 ，重庆 400016

　　【摘要】 目的 探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。方法 将原代培养的心肌细胞随机分为：①正常对照组(N组);②高糖组(H组);③高糖+Ghrelin组(G组)。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测各组心肌细胞凋亡，分光光度法检测心肌细胞内caspase3活性的变化。结果 与N组比较，H组心肌细胞凋亡明显增加，caspase3活性显著升高;与H组比较，G组心肌细胞凋亡数量明显减少，caspase3活性明显降低(均P<0.05)。结论 Ghrelin可能通过降低caspase3活性抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。

　　【关键词】 Ghrelin;高血糖;心肌细胞;凋亡caspase3

　　心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一，长期心肌细胞凋亡的发生，将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究发现，Ghrelin可以抑制多种细胞的凋亡，如成骨细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等，但Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此，本实验以高糖环境培养心肌细胞，Ghrelin作为干预因素，旨在探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响，从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞来源

　　新生1～3 d的SD大鼠的心肌细胞(重庆医科大学动物实验中心提供)。

　　1.1.2 主要试剂

　　Ghrelin(美国Phoenix Biotech公司)，DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Ⅱ型胶原酶及胰酶(均购于Sigma公司)，PBS、αactin单克隆抗体、SABC试剂盒、TUNEL检测试剂盒及DAB显色试剂盒(均购于武汉博士德生物技术公司)，caspase3 活性检测试剂盒(购于南京凯基生物公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 原代心肌细胞的分离与培养

　　取出生1～3 d龄SD大鼠10～15只，无菌条件下取心脏，仔细剥离心包膜去除心房及大血管，剩余组织于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶侧壁上，用眼科剪将心组织剪成约1 mm3碎块。加入5倍体积的0.08%胰蛋白酶，反复吹打后36℃水浴消化7 min，静置，待自然沉降后弃上清。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8 min，静置后将上清液移入10 ml离心管中，反复吹打至无细胞团块后用等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化，一般经8～10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以1 000 r/min离心8 min，弃去上清液后将细胞重悬于含15%胎牛血清的DMEM培养液，然后接种于50 ml培养瓶，37℃，5% CO2培养箱中孵育1.5 h去除贴壁的成纤维细胞。轻轻吸出上层细胞悬液，调整接种密度，将细胞接种于24孔板(板底铺盖玻片)，置37℃，5%CO2培养箱中培养(培养液中加入5溴脱氧尿嘧啶0.1 mmol/L,以抑制成纤维细胞增殖)，培养48 h换液，以后每2 d换液1次。

　　1.2.2 台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率

　　将0.4%台盼蓝溶液与细胞悬液等比例混匀，滴入细胞计数板，2 min后于倒置相差显微镜下计数，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算细胞存活率〔%，活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%〕，重复3次。

　　1.2.3 心肌细胞纯度鉴定

　　细胞培养第3天取出细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min后，用0.01 mol/L PBS漂洗3次。加入3%H2O2消除过氧化氢酶，封闭血清，室温封闭30 min后加入以1∶300稀释的兔抗大鼠特异性αactin抗体于4℃孵育过夜。然后分别用荧光标记的山羊抗兔IgG抗体37℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后立刻荧光显微镜下观察，绿色荧光染色的细胞即为阳性心肌细胞。阳性细胞百分率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%，重复3次。

　　1.2.4 实验分组

　　原代心肌细胞培养3 d后进行实验分组，分为以下3组：①正常对照组(N组)：葡萄糖浓度为5.5 mmol/L;②高糖组(H组)：葡萄糖浓度为25.0 mmol/L;③高糖+Ghrelin组(G组)：酰基化Ghrelin终浓度为107 mol/L，葡萄糖浓度为25.0 mmol/L。

　　1.2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

　　将各组细胞爬片用PBS洗3次后，4%多聚甲醛固定30 min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，同时设置阳性与阴性对照。检测结果判断：光镜下阳性细胞为细胞核中有深浅不一的棕黄色颗粒(DAB显色)。而正常非凋亡细胞及阴性对照胞核被苏木素复染呈蓝色。凋亡细胞分析：计数200倍视野下的凋亡细胞数及细胞总数，每组拍摄10个视野，计算凋亡细胞百分率(凋亡细胞/心肌细胞总数×100%)，重复5次。

　　1.2.6 caspase3活性测定

　　按照caspase3活性试剂盒说明书进行操作。收集各组实验细胞,PBS清洗2次，2 000 r/min离心5 min,去除PBS。沉淀细胞中加入50 μl预冷裂解液和0.5 μl DTT。 吹打，冰上裂解60 min，期间涡旋4次，每次10 s，4℃10 000 r /min离心1 min，吸取上清至新管中置冰上，测蛋白浓度。各组应采用同样蛋白量进行实验，加入50 μl的2×Reaction Buffer和0.5 μl DTT，加入5 μl caspase3 substrate并于37℃ 避光孵育4 h ，分光光度计在400 nm波长测定其吸光值，计算OD诱导剂/OD阴性对照确定各组caspase3活性值。

　　1.3 统计学处理

　　数据以x±s表示，用SPSS11.0软件对数据进行各组间单因素方差分析。组间两两比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 心肌细胞存活率测定

　　台盼蓝染色随即观察细胞存活率分别为95.4%，98%，96%。

　　2.2 心肌细胞形态学观察

　　刚接种的心肌细胞尚未贴壁，以圆形为主。8～12 h后，部分心肌细胞逐渐变形并贴壁生长，可出现单个细胞自发性搏动。24 h后观察细胞已大部分贴壁，单个搏动细胞数目增加，并逐渐在瓶底铺展，伸出伪足，相互接触交织成网，第48小时可形成呈同心圆放射状排列的细胞簇，搏动频率、节律、强度稳定，60～140次/min左右。

　　2.3 心肌细胞纯度鉴定

　　心肌特异性αactin单克隆抗体做免疫荧光染色鉴定，阳性率接近96%。见图1。

　　2.5 caspase3 活性测定 N组心肌细胞caspase3 活性较低;H组caspase3 活性较N组明显增加(P<0.05);G组caspase3活性较高糖组明显降低(P<0.05)。见表1。表1 各组心肌细胞凋亡率及caspase3活性测定比较(略)

　　3 讨论

　　糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管并发症之一。越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡与糖尿病心肌病密切相关，并在糖尿病心肌病的病程发展过程中起着重要作用。

　　Ghrelin是首先从大鼠胃黏膜中分离得到的一种含28个氨基酸的多肽，是生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体〔2〕。GHSR在全身多器官组织中广泛分布，心脏和血管均有表达〔3～5〕。Ghrelin与受体GHSR结合后，通过自分泌、旁分泌及内分泌形式发挥多种生物学效应。近期研究发现，除可刺激生长激素释放外，Ghrelin能够抑制多种细胞的凋亡〔6～12〕,如成骨细胞、脂肪细胞、胰岛β细胞、小肠上皮细胞、内皮细胞及大脑皮层神经元等。但目前尚未见Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道。

　　本研究显示，H组心肌细胞凋亡率较N组明显增高，说明高糖环境可以增加心肌细胞凋亡。引起心肌细胞凋亡的机制尚不清楚，可能与高血糖状态下线粒体通路及死亡受体通路激活、PKC同工酶的凋节、P53基因的参与、活性氧物质的积累和氧化应激等有关〔13〕。与H组比较，G组心肌细胞凋亡率明显降低，表明Ghrelin对高糖诱导的心肌细胞凋亡具有抑制作用。caspase3是细胞凋亡中的关键蛋白酶，是最重要的凋亡执行者。一旦caspase3被激活，细胞凋亡的发生将不可避免，因此caspase3活化也被称为凋亡发生的标志性事件。本研究中，H组较N组心肌细胞caspase3活性显著升高，表明高糖环境可以增加caspase3活性，诱导心肌细胞凋亡。而Ghrelin处理后，caspase3活性与H组相比明显降低，提示Ghrelin可能通过抑制caspase3的活化发挥抗凋亡作用。

　　本研究提示，caspase3活性降低，可能是Ghrelin保护细胞凋亡的重要机制之一。除此之外，Ghrelin还可以通过下述途径抑制细胞凋亡：①上调肿瘤坏死因子α(TNFα)，激活NFκB途径。有研究报道，Ghrelin能够减少心力衰竭时心肌细胞凋亡，同时伴有心肌细胞内TNFα增加，NFκB活性升高。表明Ghrelin抑制心肌细胞凋亡，部分可能通过激活TNFα、NFκB的死亡受体途径介导〔14〕;②激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导分子。活化的Akt通过磷酸化作用进一步激活或抑制下游靶蛋白，进而发挥调节细胞增殖、分化等作用。研究发现，Ghrelin可以激活Akt，抑制caspase3的激活，减少高糖引起的内皮细胞凋亡。予以PI3K抑制剂LY294002后，Ghrelin对caspase3的抑制作用明显减弱，显示Ghrelin可以通过PI3K/Akt通路实现抗内皮细胞凋亡的作用〔12，15〕;③抑制活性氧簇的产生。活性氧物质的过多积累是导致细胞凋亡的原因之一。Ghrelin能够抑制活性氧簇的产生，提示Ghrelin保护神经元凋亡的机制可能与减少活性氧簇产生有关〔16〕。

　　总之，研究表明Ghrelin能够抑制多种细胞的凋亡，但其影响细胞凋亡的具体作用机制尚未完全明了，有待进一步研究。Ghrelin可以通过降低caspase3的活性减少高糖诱导的心肌细胞凋亡，可能为今后糖尿病心肌病的防治提供新的治疗靶点。

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