TCDD诱导软骨细胞细胞凋亡的研究
发表时间：2009-06-25 浏览次数：725次
作者:赵玉红,吴丽霞,赵玉岩
作者单位：沈阳医学院沈洲医院检验科，辽宁沈阳110002;中国医科大学附属第一医院内分泌科
【摘要】 目的: 探讨不同浓度的TCDD对体外培养软骨细胞程序性死亡过程的影响。 方法: 胰酶消化法体外培养兔的软骨细胞;软骨细胞株暴露于二英（TCDD）24h（浓度为1×10 -10 ～1×10 -8 mol/L）;光镜和透射电镜观察软骨细胞株细胞形态变化;流式细胞仪检测软骨细胞株细胞凋亡率。 结果: 1×10 -10 ～1×10 -8 mol/L的TCDD诱导软骨细胞出现核固缩、碎裂和凋亡小体，并随TCDD浓度的增加而更明显;TCDD诱导的软骨细胞凋亡呈剂量依赖效应，1×10 -10 ～1×10 -8 mol/L浓度的TCDD作用24h后，软骨细胞株凋亡率分别为11.75%±2.41%，19.5%±2.75%，27.5%±3.45%，对照组为5.21%±2.46%，差异有显著性（P<0.05）。 结论: TCDD可以诱导体外培养的软骨细胞发生细胞凋亡。
【关键词】 二英;软骨细胞;体外培养;形态学;凋亡
1 材料与方法 1.1 动物与试剂 1月龄中国白兔，500g左右，由中国医科大学实验动物中心提供（Ⅱ级动物）。胶原酶Ⅱ型新生牛血清，胰蛋白酶，DMEM均为GiBCO公司产品。碘化丙啶（PI），吖啶橙均为Sigma公司产品。达尔伯克培养基（Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）培养液（pH7.4，Gibco），胎牛血清（FBS，Gibco），胰蛋白酶（上海华美生工），双抗（青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L，Hyclone，USA），流式细胞仪（Flow Cytometer FCM）。 1.2 软骨细胞分离及培养 处死白兔，无菌条件下取兔双膝关节，三角刀片切取兔双膝股骨髁软骨，浸入含20%新生牛血清的DMEM中漂洗，移入0.2%胶原酶Ⅱ型（用20%DMEM配制）小瓶中，用眼科剪剪碎，放入37℃，5%CO 2 培养箱中消化6h成絮状，1500rpm离心5min，弃上清，用200目不锈钢筛网过滤后分装入培养瓶中，加入20%新生牛血清DMEM进行原代培养。第一次传代用0.2%胰酶消化。倒置显微镜下细胞基本回缩时，弃胰酶，加10%新生牛血清DMEM吹打，以1:2传入六孔培养板中。 1.3 TCDD作用软骨细胞 软骨细胞常规培养于10%的DMEM（含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素），在37℃，5%CO 2 培养箱中贴壁生长。培养24h达对数生长期进行TCDD作用实验。实验分组:第1组，对照组;第2组，1×10 -10 mol/L TCDD;第3组，1×10 -9 mol/L TCDD;第4组，1×10 -8 mol/L TCDD。对照组加入等体积的二甲亚砜（DMSO），DMSO终体积不超过0.1%，此浓度的DMSO对细胞生长无明显影响。用药后24h收集细胞。 1.4 细胞形态显微镜观察 软骨细胞暴露TCDD后，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗2次，再用0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×10 6 个/ml，然后用4%多聚甲醛在室温下固定15min。进行HE染色，用乙醇脱水后在光学显微镜下观察细胞形态。 1.5 流式细胞仪检测 收集经诱导培养的细胞用预冷4℃PBS吹打，胰酶消化的细胞，1000rpm2min，弃上清，70%酒精固定，离心弃酒精，重悬于4℃PBS过夜，离心，弃PBS，加0.6ml PI染液，避光染色30min，上机检查。 1.6 资料分析 软骨细胞凋亡检测每个实验组测5次，以x±sd表示，资料比较采用方差分析（ANOVA）统计，P<0.05具有统计学意义。 2 结果 2.1 培养软骨细胞形态学观察 原代培养的软骨细胞第3d，细胞已全部贴壁，单层铺满约70%细胞成梭形，多角形、同时见一部分成团未消化组织块，但四周都有细胞爬出，伸出突起，与四周连接成网状、火焰状、漩涡状等典型成纤维细胞样表现。第4d，单层铺满80%以上。可作第一次传代。第一次传代后24h，细胞已基本贴壁，且铺满70%左右，细胞依然成梭形、多角形，细胞间连网状，漩涡状等。传代5d后，细胞大多成多角形排列紧密，大多成片排列（图1）。
2.2 TCDD致软骨细胞形态学变化 经HE染色观察，正常生长的软骨细胞呈梭形，细胞贴壁生长，细胞轮廊清楚，细胞间结构紧密，细胞胞浆丰富、均匀，细胞核规整，呈蓝色，核内染色均一（图2）。软骨细胞暴露TCDD后，软骨细胞表现为细胞可见核固缩、碎裂和凋亡小体，并随TCDD浓度的增加而更明显（图2，3）。 图1 原代培养的软骨细胞光镜检查结果（300×）（略） 图2 TCDD致软骨细胞形态学改变（HE染色光镜检查，300×）（略）
图3 TCDD致软骨细胞形态学改变（透射电镜检查，9000×）（略） 2.3 TCDD对软骨细胞凋亡的作用 TCDD诱导的软骨细胞凋亡呈剂量依赖效应，随着维甲酸浓度增加，凋亡细胞率亦增加，1×10 -10 ～1×10 -8 mol/L浓度的TCDD作用24h后，出现明显亚二倍体峰（凋亡细胞峰），凋亡率分别为11.75%±2.41%，19.5%±2.75%，27.5%±3.45%，而对照组为5.21%±2.46%，与对照组比较差异有显著性（P<0.05）。 3 讨论 环境类激素是由于人类活动而释放到环境中的一类化学物质，经过皮肤、黏膜、消化道、呼吸道进入生物体内，产生激素样的生物效应。其特点为:（1）种类繁多，分布广泛，其中具有代表性和普遍性的是TCDD和有机氯农药DDT。（2）环境类激素尽管环境浓度很低，但是由于此类物质在环境中非常稳定，难以降解，生物半衰期长，易通过食物链产生生物蓄积，最终大量蓄积于人体内，进而产生生物效应。TCDD可在啮齿类动物中产生广泛的毒性效应，包括氯痤疮、免疫、生殖和发育毒性、致癌性、废物综合征，甚至死亡 ［3］ 。凋亡是一个多基因、多因素控制的机体细胞主动性自杀过程，同时机体通过凋亡可以清除衰老和损伤细胞，达到自我保护目的 ［2］ 。某种刺激因子作为一种信号传递给细胞，引发细胞内的一系列自杀程序启动及细胞内核酸酶活力增加，进而细胞发生凋亡。 目前研究细胞凋亡的方法很多 ［4］ ，一般有细胞凋亡的形态学特征、生化特征及仪器检测。细胞形态学改变是判定发生细胞凋亡的最重要依据 ［5］ 。本研究的HE染色观察结果表明，正常生长的软骨细胞呈梭形，细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，细胞胞浆丰富，细胞核规整，核内染色均一;TCDD促进软骨细胞细胞凋亡，细胞均表现为其固有形态的丧失，可见核固缩、碎裂和凋亡小体，且随浓度的增加细胞凋亡数增多，细胞凋亡呈剂量依赖效应。流式细胞仪检测可见典型的凋亡峰。由此，我们认为1×10 -10 ～1×10 -8 mol/L浓度的TCDD能够诱导体外培养的软骨细胞发生细胞凋亡。
