体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究

作者：李晓红　马健　汪菲菲　窦立萍　李猛　高春记    作者单位：解放军总医院血液病中心 北京 100853 【摘要】  　　本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞（PBMNC）得到纯化的NK细胞，随后在干细胞培液基条件下，通过IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组（不加任何细胞因子），分别培养15天，每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后（CD3-CD56+）NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经：miniMACS阴性免疫磁珠分选后（CD3-CD56+）NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除对照组（CD3-CD56+）NK细胞纯度略下降外，其余4组与扩增前无显著性差异（P＞0.05）。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中， NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01），但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异（P＞0.05）。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组，但两组间无显著性差异（P＞0.05）。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后，应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。

【关键词】  NK细胞； miniMACS； 白介素2； 白介素12； 白介素15

　　Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral Blood

    LI XiaoHong, MA Jian, WANG FeiFei, DOU LiPing, LI Meng, GAO ChunJi

    Center of Hematology,  PLA General Hospital； Beijing 100853, China

    Abstract    Adoptive immunotherapy using allogeneic natural killer (NK) cells  provides to be useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AlloHSCT), but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First, the  NK cells were isolated  from PBMNC by using miniMACS (magnetic cellselection) and NK Cell Isolation Kit Ⅱ.   Then the isolated cells were cultured in SCEM (Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium, Sigma) supplemented with 10% human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12, IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days, and were evaluated for cell expansion, phenotype, and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12, cells were expanded 50.46±4.31 and 52.35±6.72fold respectively, much  higher than others（P＜0.01), but no significant difference between themselves  (P＞0.05). And the purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P＜0.01), although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group,  but no significant difference between themselves (P＞0.05). It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.

    Key words    natural killer cell; miniMACS ; IL2, IL12, IL15

    J Exp Hematol 2007; 15(2):373-377

    NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。最近在异基因造血干细胞移植中发现供者异源反应性NK细胞可以发挥移植物抗白血病(graftversusleukemia，GVL)效应，并减少移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)的发生［1-3］，故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植辅助治疗的新策略［4,5］。然而，外周血中NK细胞含量少（约占淋巴细胞的5%-7%），且目前尚缺乏有效的体外扩增体系，所以NK细胞的广泛临床应用受到了限制。目前的许多体外研究均显示IL2、IL12、IL15对促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。本研究从方法学角度探索提高NK细胞纯度并采用IL2、IL12、IL15等细胞因子的不同组合，以期优化NK细胞体外扩增的效率及纯度，为NK细胞的进一步临床应用奠定基础。

     材料

    NK细胞分选试剂盒（NK Cell Isolation Kit Ⅱ，包括荧光标记抗体、磁珠）及miniMACS磁珠分选系统、分离柱（MS Column）均购自德国美天意公司（Miltenyi Biotec,Germany）。造血干细胞扩增培养基(Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium，SCEM)为Sigma公司产品，RPMI 1640培养液为Gibco公司产品。人AB血清购自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15为Cytolab公司产品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine）为 Sigma公司产品。流式细胞仪及荧光抗体FITCCD3、PECD56、FITCIgG1、PEIgG1均为Becton Dickinson公司产品。CCK8 试剂盒（Cell Counting Kit8，新型细胞检测MTT法改良试剂）购自日本同仁化工。K562细胞为我科实验室长期保存。外周血来源于我院健康献血者。

    外周血采集与单个核细胞分离

    健康献血者10名，采集肘静脉外周血20 ml，肝素抗凝，用PBS等体积稀释后，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离得到单个核细胞（PBMNC），PBS洗涤1次。

    NK细胞分离纯化

    将上述PBMNC用溶红素处理，然后用MACS buffer洗涤1次，血细胞计数板计数。每107个细胞重悬于40 μl  MACS buffer，加入10　μl  NK cell biotinantibody cocktail，4-8℃孵育10分钟，然后依次加入30　μl MACS buffer、20　μl  antibiotin micro beads，4-8℃孵育15分钟，再次用MACS buffer洗涤标记好的细胞，重悬于500　μl MACS buffer中。选用MS分离柱，安放于miniMACS分离器磁场中，使用前润湿分离柱，将分离柱放置于合适的细胞收集管上。将细胞悬液上柱，用3×500　μl MACS buffer洗柱，收集细胞。纯化前后计数单个核细胞，并以CD3、CD56荧光标记抗体分析NK细胞数，计算细胞回收效率和纯化效率。

    细胞培养

    将分离纯化的NK细胞加入含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、青、链霉素（各100 U/ml）及细胞因子的SCEM培养体系内，调至细胞终浓度2×105/ml，然后接种于24孔板，每孔终体积为1 ml；培养体系按细胞因子的不同组合分为4组： A组：IL2（200 U/ml），B组： IL2(200 U/ml)+IL12(10 ng/ml)，C组：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)，D组：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)+IL12(10 ng/ml)，E组：不加任何细胞因子为对照组。每组复种3孔，置37℃、5% CO2、饱和温度培养箱中培养，每3天半量换液并全量补充上述细胞因子。于培养第0、5、10、15天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活性。

    免疫表型分析

    将取自不同来源的细胞用荧光抗体CD3FITC、CD56PE标记，流式细胞仪检测及分析，了解NK细胞纯度。

    白血病细胞系的培养

    K562细胞种于含有10%FCS的 RPMI  1640培养体系中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。

    NK细胞杀伤活性检测

    收集对数生长期K562细胞及培养第0、15天NK细胞。以K562细胞为靶细胞，调整细胞密度为1×105 /ml；NK细胞为效应细胞，根据不同效靶比分别调整细胞密度为1×105 /ml、5×105 /ml、1×106 /ml。按不同效/靶比（1∶1、5∶1、10∶1 ）将效应细胞与靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养12小时后每孔加入10  μl CCK8（ Cell Counting Kit8：新型细胞检测MTT法改良试剂），混匀，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定每孔450 nm波长处的OD值。细胞毒活性的计算方法：求出3个平行孔的平均值，按以下方法计算NK细胞毒活性，以杀伤率%表示。

    细胞毒活性=［1-（效靶细胞作用孔OD值-效应

    细胞孔OD值）/靶细胞孔OD值］×100%

    统计学处理

    所有数据均以（±SD）表示，组间比较采用方差分析，所有统计学分析均采用CHISS 2004统计软件进行。

    结    果

    NK细胞纯化效率

    10名献血者标本显示，2×107个外周血单个核细胞经分选后可获得（2.56±1.23）×106个CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%（图1）。

    NK细胞增殖情况

    各组实验条件下NK细胞计数情况见图2。培养期内台盼蓝染色示细胞存活率均为95%以上。培养前5天，各组细胞增殖均较缓慢；最快增殖时间出现于培养第2周，即第7-15天，此阶段各组培养条件下NK细胞均较培养初期显著扩增。培养至第15天IL2组、IL2+ IL12组、IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组NK细胞的扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01）。IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组细胞的扩增倍数显著高于IL2组、IL2+ IL12组（P＜0.01）。在这10例标本中，IL2+IL15+IL12组虽然曾获得一次最大扩增倍数60.8倍，同时平均扩增倍数也略高于IL2+IL15组，但统计学分析显示它们的扩增效率无显著差异（P＞0.05）。

    NK细胞扩增前后免疫表型分析

    取自于培养第15天的细胞分别标记CD3、CD56抗体，结果显示在含有细胞因子的4组培养体系中，CD3-CD56+NK细胞纯度均大于94%，与开始培养时（0天）NK细胞纯度无显著差异（P＞0.05）。对照组CD3-CD56+NK细胞纯度为83.26±6.39%，较其余各组及培养初始时略有下降（P＜0.05）（图2）。

    NK细胞对K562细胞的杀伤作用

    分别比较培养15天后各细胞因子组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞（E0组）对K562细胞的杀伤率的变化。如图3所示：各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且NK细胞对K562 细胞的杀伤活性呈C组≈D组（P＞0.05）＞B组＞A组＞E组（P＜0.01）。随着效靶比从1∶1、5∶1到10∶1，各组NK细胞对K562细胞的杀伤率均逐步提高（P＜0.01）（图3）。

    讨    论

    目前的研究证实，NK细胞是造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及抗肿瘤免疫中非常有应用价值的效应细胞之一。尤其在造血干细胞/骨髓移植方面，许多的动物实验和临床观察均提示异基因造血干细胞移植后，供者的异源反应性NK细胞可促进植入，阻止T细胞介导的GVHD，攻击宿主白血病细胞发挥GVL效应。故输注供者异源反应性NK细胞已成为临床移植辅助治疗的新策略。如何获得高纯度、足够数量的NK细胞是临床应用的前提条件。虽然国内外有应用ClinMACS直接从供者外周血中分选NK细胞，但用血量大，分选费用昂贵，获得的NK细胞量仍不能满足临床需要，往往需要体外进一步扩增［6］，这些问题均大大限制其临床应用。近年来Carlens［7］、Klingemann［8］、黎阳等［9］国内外学者都曾尝试建立人NK细胞体外扩增体系，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高，应用饲养细胞等问题，这些研究虽然部分的满足了科研的需要，但临床应用问题尚未解决。尤其对于移植免疫中对NK细胞的需要，由于移植前后受者处于特殊的免疫状态中，不同免疫细胞对患者影响不同，故输注时NK细胞的纯度直接关系到输注后的疗效。本研究在前人研究的基础上，先采用miniMACS免疫磁珠分选方法，从正常人外周血中得到高纯度的NK细胞，随后优化NK细胞培养体系进行体外扩增，以降低大量分选NK细胞的昂贵费用。从我们NK细胞分选的实验结果看，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的（11.19±5.25）%提高到（94.23±3.50）%，肯定了经miniMACS高梯度磁场的NK细胞阴性免疫磁珠分选方法的分选效果。

    进一步优化NK细胞体外扩增体系时，在选用，含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的SCEM培养体系基础上，我们又选择细胞因子IL2、IL12、IL15组成不同的组合。文献报道IL2，IL12，IL15均对于促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。IL2是一种多功能的炎性细胞因子，能够激活NK细胞，诱导NK细胞增殖及细胞因子的产生［10］。IL12最先从人B淋巴母细胞系的培养上清液中发现，它不仅可促进NK细胞的杀伤活性和分泌功能，而且可在体外促进NK细胞的增殖，同时可协同IL2诱导健康成人NK的细胞因子激活的细胞毒作用［11］。IL15在刺激NK细胞增殖及活化等方面与IL2有许多相似性。当然，这与二者都可与IL2受体复合体的β、γ链结合有关。然而，IL15还可结合于1个新的α链，即IL15受体［12,13］，故IL15还在促进造血干细胞定向分化为NK细胞,并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活等方面有显著作用。另外IL2与IL15也具有协同作用。所以，我们根据不同细胞因子组合将培养体系分为4组：IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组，以期筛选出最佳组合。实验结果显示：经过15天的培养，与对照组相比，上述细胞因子均能促进NK细胞的体外扩增，并能保持扩增体系中NK细胞的高纯度；其中IL2+ IL12组虽较IL2组添加了IL12，但增殖效果的提高并不明显，同样情况也可在上述分组的后2组中看到，这说明IL12在体外对NK细胞增殖的促进作用远不及IL2，两者结合并不比单独使用IL2更有效，这与前人的一些实验结果吻合；同时在IL2组与IL2+IL15组的比较中我们看到，IL15与IL2的组合大大提高了扩增倍数，由单独使用IL2 时的15.43±1.08倍增至50.46±4.31倍，说明IL15能显著促进NK细胞的体外扩增，并可协同IL2大大提高扩增效率；而IL2+IL15+IL12组在实验中虽然有1例标本获得了最大增值倍数60.8倍，但统计学结果显示其并不比IL2+IL15组有更好的扩增效率。

    为了检测所得NK细胞的活性，我们在进一步的实验中分别比较了培养15天后实验组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞对K562细胞的杀伤率的变化。结果各组效靶比与杀伤率呈正比，从1∶1、5∶1到10∶1对K562细胞的杀伤率逐步提高（P＜0.01），这说明在一定条件下，NK细胞杀伤活性存在量效关系。其次，各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且杀伤活性呈IL2+IL15组≈IL2+IL15+IL12组（P＞0.05）＞IL2+ IL12组＞IL2组＞对照组（P＜0.01）；体外扩增后当效靶比为10∶1时，各组对K562 细胞的杀伤率均在60% 以上，其中IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组接近100%。即使当效靶比1∶1时，这两组NK细胞对K562细胞的杀伤率也从扩增前的17%提高到45%，NK细胞活性显著增强（P＜0.01）。另外结果还显示，虽然IL12可增强NK细胞的细胞毒活性，但其效果略逊于IL2及IL15，尤其后二者的组合可在效靶比为10∶1时达到近乎100%的杀伤率。

    总之，经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后，在含IL2(200 U/ml)+ IL15(20 ng/ml)的SCEM（含10%人AB血清的）培养条件下，我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增殖倍数较高的NK细胞，同时培养扩增条件简单，成本较低，为NK细胞用于造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫生物治疗奠定了良好基础。

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5李晓红，高春记.异基因造血干细胞移植中NK细胞的作用.中国实验血液学杂志, 2006；8：350-354

6Koehl U, Esser R, Zimmermann S，et al. Ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klin Padiatr, 2005;217:345-350

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12Lin SJ, Chao HC, Yan DC. Phenotypic changes of Tlymphocyte subsets induced by interleukin12 and interleukin15 in umbilical cord vs peripheral blood mononuclear cells. Pediatr. Allergy Immunol, 2001; 12:21-26

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