胃癌神经内分泌分化的组织形态与c-erbB-2关系研究

胃癌神经内分泌分化的组织形态与c-erbB-2关系研究作者：陈旭东    作者单位：江苏省南通市肿瘤医院病理科，通州226361    【摘要】  目的:探讨胃癌伴神经内分泌分化的组织形态及其与c-erbB-2的关系。方法：采用免疫组化法检测168例手术切除石蜡包埋的胃癌标本CgA,Syn,NSE表达情况，阳性病例再通过电镜检查，超微结构下找到NE颗粒者为作为胃癌伴NE分化的阳性组,其余的均为阴性组。所有病例均进行c-erbB-2免疫组化检测。结果：在168例胃癌中,39例(23.4%)超微结构下发现NE颗粒。胃癌伴NE分化与胃癌的组织学类型,组织学分级,浸润深度,脉管内癌栓,淋巴细胞浸润量,淋巴结转移情况及c-erbB-2的高表达均无明显相关性(P>0.05)，胃癌伴NE分化在Ⅲ期和Ⅳ期病例中比例(25/81)明显高于Ⅰ期和Ⅱ期病例中的比例(13/86)，二者差异有统计学意义(P<0.05)。NE分化伴c-erbB-2表达总体预后差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：胃癌伴NE分化与临床分期有关，而与c-erbB-2及胃癌的组织学类型,组织学分级等无明显相关性(P>0.05)。    【关键词】  胃癌 神经内分泌 免疫组织化学法 C-erbB-2    Study of the relationship between morphous and c-erbB-2 of the gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation   CHEN Xudong, HE Song, 1ZHANG Ting, et al      (Department of  Pathology, Nantong Tumor Hospital, Tongzhou 226361； 1Department of  Pathology, Medical College, Nantong University)    [Abstract]   Objective:To discuss the relationship between the morphous and c-erbB-2 of the gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation.Methods:168 paraffin embedding specimens with gastric carcinoma were marked with CgA,Syn and NSE, and positive cases were investigated by electron microscope.The ones which had found the neuroendocrine(NE) granules under the electron microscope belong to the positive group,the others belong to the negative.All the cases are detected using the immunohistochemistry. Results: In 168 cases with gastric carcinoma , 39 cases(23.4%) had positive NE granules. Gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation has no clear relationship with histological type,histological grading ,infiltrative depth,vessel metastasis,the amount of lymphocytes infiltration ,lymph nodes metastasis and the high expression of c-erbB-2 (P>0.05)，the ratio of gastric carcinoma with　neuroendocrine differentiation in the cases of Ⅲ stage and Ⅳ stage (25/81) is higher than the ratio ofⅠ~Ⅱ stage (13/86)，the difference is significant(P<0.05).The cases of NE differentiation with c-erbB-2 expression have no significant differences （P＞0.05）.Conclusions：Gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation  has relationship with the clinical stage ，but no obvious relationship with histological type,histological grading and so on (P>0.05).    [Key words]   Gastric carcinoma；Neuroendocrine(NE); Immunohistochemistry; C-erbB-2    胃是最重要的弥漫性内分泌器官之一。传统认为只有胃类癌、小细胞癌具有神经内分泌功能。近年来研究发现普通型腺癌也具有神经内分泌（NE）分化，但胃腺癌伴NE分化现象在光镜下难以判断，而超微结构观察及免疫组化染色对确定有无NE分化均具有重要意义,其中电镜检查找及NE颗粒最可靠。国内外对胃癌神经内分泌免疫组化的临床病理研究较多，而相关的电镜研究则较少，且标本含量也较小，其原因可能是由于电镜样本制作周期长,费用高,设备昂贵,一般医院难以普及。本研究对168例普通型胃癌进行免疫组化定位，利用电镜技术，超微结构下寻找NE颗粒，并进行胃癌伴NE分化的临床病理研究。1   材料与方法    1．1   一般资料   选取1990年1月~1995年12月间在南通市肿瘤医院行根治性手术、资料完整，并有5年以上随访结果的普通型胃癌168例。将这168例重新阅片观察，病理诊断及临床分期参照2000年WHO分类[1]。168例胃癌中男119例，女49例。年龄34~77岁，平均56.37岁。组织学类型：管状腺癌127例，乳头状腺癌22例，黏液腺癌8例，印戒细胞癌4例，未分化癌7例。分化程度：分化好100例，分化差68例。浸润程度：浸润至浅肌层27例，深肌层或全层141例。脉管内有癌栓32例，无癌栓136例。临床分期：Ⅰ、Ⅱ期87例，Ⅲ、Ⅳ期81例。癌旁淋巴细胞浸润数量少者52例，数量多者116例。胃旁淋巴结转移105例，无转移63例。    1．2   免疫组织化学染色   免疫组织化学染色方法采用二步法。鼠抗人NSE单克隆抗体、兔抗人Syn多克隆抗体、兔抗人CgA多克隆抗体及PV6000为北京中杉生物技术有限公司产品。兔抗人c-erbB-2多克隆抗体购自美国ZYMED公司。抗体的稀释度分别为NSE（1∶100）、Syn（1∶100）、CgA（1∶50）、c-erbB-2（1∶150）。组织切片经二甲苯脱蜡、乙醇水化后，抗原热修复3分钟，冷却后用PBS缓冲液冲洗3次，滴加一抗、室温37℃孵育60分钟，再用PBS缓冲液冲洗3次，滴加二抗，室温孵育45分钟后用PBS缓冲液冲洗3次，最后用DAB显色，经蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。    1．3   电镜检查   取CgA、Syn或NSE标记阳性样本二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，然后经2．5％戊二醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗，再用锇酸固定。脱水后树脂包埋制成半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下选取病变部位，制成超薄切片，铅—铀双重染色，在H-600EX型电子显微镜下观察拍照。    1．4   判断标准   电镜下发现神经内分泌颗粒即判断为NE分化。CgA、Syn及NSE染色均定位于细胞浆，c-erbB-2染色定位于细胞膜，阳性信号呈棕黄色或棕褐色。CgA、Syn、NSE及c-erbB-2染色判断标准参照复旦大学肿瘤医院许良中教授的方法进行，首先按染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕黑色。再按阳性细胞占肿瘤细胞的百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%~50%为2分，51%~75%为3分，＞75%为4分。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分的乘积作为判断标准：0~3分为“-”，4~6分为“+”，7~9分为“++”，10~12分为“+++”。免疫组化结果“-”或“+”划定为低表达，“++”或“+++”为高表达。    1．5   统计学方法   用Stata7.0医学统计软件对资料进行χ2检验及Kaplan-Meier生存曲线作图，P＜0.05示差异有统计学意义。2   结      果     2．1   c-erbB-2免疫组化结果   168例患者中c-erbB-2高表达31例，低表达137例。    2．2   电镜观察结果   88例神经内分泌标记结果阳性患者中，8例因蜡块不能满足电镜取材要求而予剔除，其余80例进行了电镜观察，其中39例找到NE细胞，阳性率为23.4%（39/168）。电镜下神经内分泌细胞数量多少不等；细胞大小不一，极性紊乱；染色质以常染色质为主；可见大而不规则核仁，内分泌颗粒在胞浆中分布失去极性，颗粒直径80~500nm，颗粒数量多少不等(图1)。依据内分泌颗粒的不同可分为3种类型：I型，分泌颗粒呈多形性、小而电子密度高，平均直径100～200nm，类似于EC细胞。Ⅱ型，分泌颗粒圆，平均直径在100~250nm，界膜较完整，常伴致密核心和空晕；有的颗粒呈囊泡状，中心有一不规则低电子密度核心，胞浆内可见丰富粗面内质网、多聚核糖体，类似于ECL细胞。Ⅲ型，分泌颗粒直径较大，150～500nm，有的呈空泡状内含低电子密度絮状核心，有的呈中等电子密度。不同类型的颗粒可出现于同一病例中。    2．3   观察的临床病理参数   包括胃癌组织学类型,分化程度,浸润深度,脉管内癌栓,临床分期,淋巴细胞浸润量, c-erbB-2的表达情况等。对资料进行χ2检验，结果显示胃癌组织学类型、分化程度、浸润深度、脉管内癌栓、淋巴细胞浸润量及c-erbB-2高表达的P值均＞0.05，提示它们与胃癌伴NE分化无显著相关。临床分期与胃癌伴NE分化显著相关，见表1。另外，我们在研究中发现胃癌中NE分化细胞与主体瘤细胞相比分化程度大部分一致(28/39)，而且另有9例病例中NE分化细胞较主瘤细胞分化高（图3）。从表2及图2中我们发现NE分化伴C-erbB-2高表达5年生存率最低，NE分化生存率明显低于不伴NE分化生存率，但NE分化伴C-erbB-2表达总体预后差异无统计学意义。3   讨      论    有报道结果显示分化差的胃癌NE分化的阳性率高[2~4，6]，他们认为NE分化细胞可以是低分化胃癌中的一种成分，肿瘤愈原始癌细胞基因越不稳定，活动范围越大而且多向分化的潜能越强、分化愈差的肿瘤，愈倾向于广泛的NE分化。我们研究发现在中—低分化腺癌中NE细胞检出率似乎高于高分化腺癌中NE细胞的检出率，但差异无统计学意义(P>0.05)，并且中分化腺癌中NE检出率与低分化癌中NE检出率比较接近。另外，我们在研究中发现胃癌中NE分化细胞与主体瘤细胞相比分化程度大部分一致(28/39)，而且另有9例病例中NE分化细胞较主瘤细胞分化高（图3）。只有2例NE分化细胞比主体瘤低。这似乎表明在同一肿瘤内分化较好的区域更容易出现NE分化。    我们在观察中发现胃癌中伴NE分化的细胞极大部分很难与不伴NE分化的细胞区别。在高中分化腺癌中NE细胞呈点状，线状或团分布，大部分细胞呈锥体形或长条形，浆略呈嗜酸颗粒状，少部分核小深染卵圆形，大部分核中等大小，核染色质淡染，此等分化细胞与周围非NE分化细胞在HE状态下较难区分。这种细胞类似于类癌细胞。低分化胃癌中，NE细胞呈圆形，卵圆形或不规则形，极性消失，细胞核见有明显异形，核仁明显，核分裂多见与周围非NE分化胃癌细胞在HE下根本没法区分。    c-erbB-2属生长因子受体类癌基因，它对许多表皮细胞生长、分化和转移具有重要的调控作用，其活性大小与许多肿瘤的发生、发展、病情轻重密切相关。姚根有等[5]报道乳腺癌中NE分化的病例中c-erbB-2高表达率明显高于不伴NE分化的病例，c-erbB-2高表达是预后不良指标。我们的研究结果显示NE分化与c-erbB-2的高表达无显著相关性。NE分化阳性病例预后明显差于NE分化阴性病例，但与c-erbB-2表达无关。    Funda EREN等[7]对42例胃癌进行CgA染色，结果发现其中19例伴有神经内分泌分化，胃癌伴神经内分泌分化者与其病理类型无关，与胃癌分期和淋巴结转移有关；国内学者[3]对88例胃癌进行NSE、Syn、CgA标记，发现胃癌神经内分泌分化与组织类型、分化程度及肿瘤大小和浸润深度有关，而与淋巴结转移及临床分期无关。而朱斌等[8]用Syn、CgA对100例胃癌染色，检出神经内分泌分化阳性34例，并得出结论，胃癌伴神经内分泌分化主要分布于TNM III、IV期组（P<0.05）；刘俊茹等[9]则选择了120例普通型胃癌，用SP法标记其神经内分泌细胞，发现未分化组的神经内分泌阳性癌细胞明显多于高分化组。本研究发现伴NE分化的胃癌与胃癌组织旁淋巴细胞浸润量、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移、有无癌栓(脉管内)均无显著相关性。但临床分期III-IV胃癌病例中NE分化的胃癌比例(25/81)明显高于无NE分化的胃癌比例(13/86)，临床分期与NE分化显著相关。这与朱斌的报道结果一致。本研究报道的结果与他人报道的结果不太一致最主要的原因是胃癌伴NE分化研究方法和诊断标准不一致。【参考文献】  [1] Hamilton SR, Altonen LA． Pathology and Genetics, Tumors of the Digestive System[K]． WHO,2000: 53-58.  [2] 王桂兰，陈 莉．胃粘液癌和普通型胃癌中P53蛋白、CgA和Syn的表达[J]．临床与实验病理杂志，1998，14（3）：227-231．   [3] 李患珍，郑丽瑞．普通型胃癌伴神经内分泌分化的免疫组织化学观察[J]．临床消化病杂志，2005，17(5)：206-208．   [4] Akishi O，Masayoshi M，Tomomi O， et al． Endocrine differentiation of gastric adenocarcinoma[J]．Cancer，1988，62：1096-1099．  [5] Yao G, Zhou J, Zhao Z, et al． Biological characteristics of breast carcinomas with neuroendocrine cell differentiation[J]． Chinese Medical Journal， 2004，117 (10) ：1536-1540．  [6] Yao GY, Zhou JL, Lai MD, et al． Neuroendocrinemarkers in adeno-carcinomas： an investigation of 356 cases[J]． World J Gastroenterol,2003, 9 (4)：860-861．  [7] Funda E, 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