雌激素加间断孕激素对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松模型子宫及骨组织形态计量学的影响

作者：郭影 底建敏 马秀敏 闫晓娟 庞义存    作者单位：河北医科大学第三医院妇产科，河北 石家庄 050051

【摘要】  目的 观察雌激素(E)加间断孕激素(P)对双侧卵巢切除(OVX)大鼠骨组织形态计量学的影响。 方法 35只雌性大鼠随机分成5组，每组7只。①假手术 (Sham) 组、②卵巢切除 (OVX) 组、③卵巢切除加雌激素 (OVX+E) 组、④卵巢切除加孕激素 (OVX+P) 组、⑤卵巢切除加雌激素和孕激素 (OVX+E+P) 组。实验10 w后处死大鼠，称取大鼠子宫和股骨湿重，并测定子宫内膜厚度、骨密度，并对第4、5腰椎进行骨组织形态计量学分析。结果 与Sham组相比:OVX组和OVX+P组体重和骨组织形态计量学参数TbSp和MAR增加，子宫重量、股骨重量和BMD减少，子宫内膜变薄，骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh减少(P＜005)；而OVX+E+P组股骨重量、BMD、子宫重量、子宫内膜厚度和骨组织形态计量学参数BV/TV、TbTh 、TbSp和MAR均无明显差异(P＞005)。OVX+E组子宫重量明显增加、子宫内膜明显增厚(P＜005)。 结论 单用孕激素不能阻止OVX导致的骨丢失；单用雌激素导致OVX鼠子宫重量增加和子宫内膜增厚；雌激素加间断孕激素能阻止OVX导致的骨丢失和体重增加,并可避免OVX和雌激素对子宫内膜的不良作用；孕激素的间断加入不影响雌激素对OVX大鼠骨代谢的有利作用。

【关键词】  骨质疏松，绝经后；去卵巢；雌激素；孕激素；骨组织形态学

　　雌激素替代治疗(ERT)来阻止绝经后骨质疏松(PMO)的发生、发展，取得了一定的疗效，但长期单纯使用雌激素有一定的副作用，而孕激素可对抗雌激素的副作用。目前常用的HRT有序贯疗法和持续疗法，前者常伴周期性阴道出血，后者则可能导致子宫内膜萎缩；并在最初使用的6个月内易发生突破性阴道出血〔1〕，令病人难以接受，常不能坚持用药，因而达不到HRT的目的。本文对去势大鼠股骨、子宫的检测及第4、5腰椎进行骨组织形态计量学分析，以探索一种比较合理的HRT。

　　1  材料与方法

　　11  材料  选取3月龄、体重(19929±1543)g的Wistar雌鼠(中国军事医学科学院动物中心提供)35只。随机分成5组，每组7只。①假手术 (Sham) 组、②卵巢切除 (OVX) 组、③卵巢切除加雌激素 (OVX+E) 组、④卵巢切除加孕激素 (OVX+P) 组、⑤卵巢切除加雌激素和孕激素 (OVX+E+P) 组。动物条件一致，均在(22±2)℃室温、灯光12 h交替、相对湿度55%的屏障系统内饲养，给予标准全价颗粒饲料喂养。

　　12  实验药物  雌激素选用苯甲酸雌二醇注射液，1 ㎎/支 (上海第九制药厂生产)，每3 d皮下注射1次，每次注射35 μg/kg。孕激素选用黄体酮注射液，20 ㎎/支，(浙江仙居制药股份有限公司生产)，皮下注射3 d(每天1次，每次1 ㎎/㎏),停用3 d。骨标记物选用盐酸四环素(TH)250 ㎎/支(上海华美公司生产)，按30 mg/Kg每天分2次灌胃，在处死动物前15 d连续使用2 d，进行第1次标记；停药9 d后(即处死大鼠前第4天)，进行第2次标记，方法同前。

　　13  方法

　　131  建立模型  将大鼠以1%硫喷妥钠40㎎/㎏腹腔注射麻醉，无菌条件下，经腰部正中纵切口进入腹腔背侧，将②～⑤组大鼠双侧卵巢切除，①组仅行开关术。术后正常摄食水。1 w后③～⑤组开始用药，且给药剂量每周按体重校正1次，10 w后处死全部大鼠。

　　132  标本制备  喂养10 w后称重、断头处死大鼠，留取全血后，于低温超速离心机离心后取血清待检；分离大鼠子宫、右侧股骨和第4、5腰椎，使用钮力天平(精确到01 g)称湿重后，以10%福尔马林固定。

　　133  子宫内膜厚度测量  于大鼠双角子宫分叉处上方5 mm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，在目镜上装有测微尺的普通显微镜下测量子宫内膜厚度。

　　134  骨密度测量(BMD)  将分离的股骨使用美国LUNAR DPXL 6843型双能X线骨密度仪测定BMD，每只测定2次，取均值。

　　135  骨组织形态计量学分析

　　1351  不脱钙骨切片的制备  将留取的L4～L5骨标本置于10%福尔马林内固定，依次用40%、70%、95%和100%乙醇脱水，二甲苯中固定4 h，甲基丙稀酸甲酯包埋，42℃烤箱内聚合凝固。使用德国ReichertJung公司生产的POLYCUTS型切片机沿椎体矢状面做不连续切片，在椎体中矢面时，分别取厚度为10 μm和5 μm切片各2张，10 μm切片不染色供荧光观察用，5 μm 切片用1%甲苯胺蓝染色。

　　1352  参数测量  采用德国OPTON公司生产的ⅢRS 型计算机半自动图象分析系统，每只鼠观察荧光切片和甲苯胺蓝染色切片各2张。测量参数如下〔2，3〕：    　　相对骨小梁体积(trabecular bone volume／total bone volume,BV/TV)= 骨小梁面积/总面积×100%。    　　平均骨小梁厚度(mean trabecular thickness,TbTh)μm = 200×骨小梁面积/1199×骨小梁周长。    　　平均骨小梁间隔(mean trabecular spacing，TbSp)μm = 200×(总面积－骨小梁面积)/1199×骨小梁周长。    　　　　矿化沉积率(mineralization rate,MR)μm／d = 荧光双标记间距/双标记间隔时间。

　　14  统计学方法  实验数据使用SPSS100统计软件包进行统计学分析，所有数值均以x±s表示。

　　2  结果

　　21  实验前后各组大鼠体重变化  实验前，各组间大鼠体重无统计学无差异。实验10 w后，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组体重均明显增加(P＜005)；OVX+E组和OVX+E+P组体重则无明显变化(P＞005)。与OVX组相比：OVX+E组和OVX+E+P组体重则明显减少(P＜005)。见表1。

　　22  股骨重量和BMD的比较  从表1中可以看出，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组股骨重量减轻，同时BMD减少(P＜005)；而OVX+E组和OVX+E+P组股骨重量和BMD无明显差异(P＞005)。与OVX组相比：OVX+E组和OVX+E+P组股骨重量和BMD明显增加(P＜005)；而OVX+P组则无明显差异(P＞005)。

　　表1  各组大鼠体重及股骨重量、BMD的比较（略）

　　Sham组相比：1)P＜005，2)P＜001；与OVX组相比：3)P＜005；表2同

　　23  各组大鼠实验后子宫重量和子宫内膜厚度的对比  实验10 w后，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组子宫重量明显减少、子宫内膜明显变薄(P＜005)；OVX+E组子宫重量明显增加、子宫内膜明显增厚(P＜005)；而OVX+E+P组则无显著性差异(P＞005)。见表2。

　　表2  实验后各组大鼠子宫重量和子宫内膜厚度的对比（略）

　　24  各组大鼠骨组织形态计量学参数比较  表3中可见，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh减少，TbSp和MR增加 (P＜005)；而OVX+E组和OVX+E+P组骨组织形态计量学参数BV/TV、TbTh、TbSp和MR均无明显差异(P＞005)。与OVX组相比：OVX+E组和OVX+E+P组骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh 明显增加，TbSp和MR明显减少 (P＜005)；而OVX+P组骨组织形态计量学参数BV/TV、TbTh 、TbSp和MR均无明显差异(P＞005)。

　　表3  各组大鼠骨组织形态计量学参数比较（略）

　　与Sham组相比：1)P＜001；与OVX组相比：2)P＜005，3)P＜001

　　3  讨论

　　31  OVX导致体重增加、骨丢失、子宫内膜萎缩  实验前后各组大鼠体重无差异，实验10 w后OVX组大鼠体重明显增加，尽管这种改变可部分抑制OVX导致的骨丢失〔5〕，但与Sham组相比，其股骨重量和BMD都明显减少，其骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh明显减少、TbSp和 MR明显增加，说明OVX导致骨形成率增加，但由于破骨细胞骨吸收活性加强，骨吸收大于骨形成，所以表现为骨小梁体积减少，厚度降低，间隙增加，从而骨量减少(见表3)；同时显示，不同药物的摄入导致的骨代谢改变与这些动物的体重改变无直接关系(见表1)。与Sham组相比，OVX组大鼠子宫重量减少、子宫内膜变薄，且具有统计学意义，说明OVX导致子宫内膜萎缩，与临床资料一致。

　　32  ERT预防OVX的骨丢失  雌激素缺乏是PMO 发病的主要原因，其详细机制尚未完全阐明，但已知雌激素通过多种途径参与骨代谢，雌激素可抑制骨吸收，减少骨丢失。1987年Eriksen等〔4〕首次证实，成骨细胞上存在着雌激素受体，雌激素可直接调节骨代谢。近年来的研究表明，破骨细胞也是雌激素的靶细胞〔5〕，雌激素通过促进破骨细胞的凋亡而调节部分骨代谢(雌激素受体调节机制)〔6〕。表1、表3显示，对OVX鼠使用ERT，无论是否加用孕激素，其股骨重量和BMD都与Sham组接近，且体重与Sham组无明显差异，其骨组织形态计量学参数BV/TV、TbTh 、TbSp和MR均与Sham组接近。表明ERT通过阻制骨高转换，增加骨小梁体积和厚度，减小骨小梁间隙,从而阻止OVX导致的骨丢失，并能避免雌激素缺乏引起的体重增加。

　　33  单纯使用雌激素导致子宫重量增加和子宫内膜增厚  表2显示，与Sham组相比，对OVX鼠单纯使用雌激素，其子宫重量和子宫内膜厚度增加，说明雌激素引起子宫内膜过度增生。雌激素可作用于其在子宫内膜的受体，导致子宫内膜增殖。临床资料显示，长期使用雌激素使子宫内膜癌发病率增加。研究表明，接受结合雌激素1年以上的妇女当停止使用以后，仍可使危险性增加至少10年，因而妇女应长期进行妇科监视〔7〕。

　　34  单用孕激素不能阻止OVX导致的骨丢失  表1显示，对OVX鼠单独使用孕激素，其骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh减少，TbSp和MR增加；其股骨重量和BMD与OVX组无明显差异，而明显低于Sham组；说明单用孕激素不能阻止OVX导致的骨丢失。

　　35  间断加用孕激素可对抗OVX致子宫内膜萎缩和雌激素致子宫内膜增殖的负作用  表2中可以看出，与Sham组相比：对OVX鼠单纯使用雌激素引起子宫重量增加和子宫内膜增厚；而混合使用雌孕激素组子宫重量和子宫内膜无明显变化。说明孕激素的使用阻止了子宫内膜的过度增生。孕激素也可以作用于其在子宫内膜的受体，阻止子宫内膜的增殖，使增生过长的子宫内膜转化为分泌期，进而防止子宫内膜癌的发生。

　　36  雌激素加间断孕激素阻止OVX导致的骨丢失，而且避免了对子宫内膜的不利作用  本实验显示，对OVX鼠使用雌激素加间断孕激素，其股骨重量和BMD均明显高于OVX组和OVX+P组，其骨组织形态计量学参数BV/TV和TbTh明显高于OVX组，TbSp 和MR则明显低于OVX组，而与Sham组和OVX+E组相似；其子宫重量和子宫内膜厚度均明显低于OVX+E组，与Sham组相似。说明雌激素加间断孕激素阻止了OVX导致的骨丢失，而且避免了OVX致子宫内膜萎缩和雌激素对子宫内膜的过度增生的不良作用；孕激素的加入没有影响雌激素对OVX大鼠骨代谢的有利作用。孕激素与雌激素混合使用时不会抑制OVX鼠的雌激素活性，与Yamamoto〔8〕的骨组织形态学研究一致。    　　另外，雌激素加间断孕激素还预防了OVX引起的体重增加。实验后雌孕激素组体重明显低于OVX组和OVX+P组，与Sham组无差异。Casper等〔9〕的临床资料表明，这种新的HRT明显降低了阴道出血率，很好的控制了潮热等更年期症状，定期活检子宫内膜未发现增生，与治疗前相比，血压和体重无变化。与持续疗法相比，这种方法可以使雌激素和孕激素对雌激素应答组织的敏感性增加〔10〕。与序贯疗法相比，这种方法很可能将大大减少孕激素的用量，因为孕激素受体和随后的子宫内膜对孕激素的敏感性可以再三更新。    　　尽管近年来关于HRT治疗的疗效以及其远期对机体的负面影响争论很多，但由于其对缓解更年期症状、预防直肠癌以及减少髋关节骨折起着非常重要的作用，目前很多国家仍在使用。只是医生和病人在考虑应用HRT时需要经过仔细的评估和讨论，并在治疗过程中应严密监测患者的症状和危险因素〔11〕。

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