雌激素加间断孕激素对去卵巢大鼠模型骨转换生化指标的影响

作者：郭影 王健 闫晓娟 马秀敏    作者单位：河北医科大学第三医院妇产科，河北 石家庄 050051

【摘要】  目的 观察雌激素（E）加间断孕激素（P）对双侧卵巢切除（OVX）大鼠模型骨转换生化指标的影响。方法 35只雌性大鼠随机分成5组，每组7只。①假手术 (Sham) 组、②卵巢切除 (OVX) 组、③卵巢切除+雌激素 (OVX+E) 组、④卵巢切除+孕激素 (OVX+P) 组、⑤卵巢切除+雌激素+孕激素 (OVX+E+P) 组。实验10 w后处死大鼠，测定股骨重量、骨密度（BMD），检测血清骨钙素（BGP）、碱性磷酸酶（ALP）、钙、磷，同时检测尿钙、羟脯氨酸(HOP)及肌酐(Cr)等指标。结果 与Sham组相比:OVX组和OVX+P组体重增加、股骨重量和BMD减少(P＜0.05)，血清BGP、ALP及尿钙、HOP及Cr升高，而OVX+E组、OVX+E+P组股骨重量和BMD、血清BGP、ALP及尿钙、HOP及Cr均无明显差异（P＞0.05）。结论 单用孕激素不能阻止OVX导致的骨吸收及骨量丢失；雌激素+间断孕激素能阻止OVX导致的骨吸收及骨量丢失；孕激素的间断加入没有影响雌激素对OVX大鼠骨代谢的有利作用。

【关键词】  骨质疏松　绝经后　去卵巢　雌激素　孕激素　骨密度　骨转化生化指标

　　The effect of estrogen and interrupted progestin on bone turnover biochemical markers in ovariectomized rats

　　GUO Ying, WANG Jian, YAN XiaoJuan, et al.

　　Department of Gynaecology and Obstetrics, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China

　　【Abstract】  Objective  To investigate the effect of estrogen (E) and interrupted progestin (P) on bone turnover biochemical markers of ovariectomized (OVX) rats.Methods  35 Wistar female rats were randomly divided into 5 groups (7 in each group): ①Shamoperated (Sham); ②OVX; ③OVX+E; ④OVX+P; ⑤OVX+E+P.The rats were killed 10 weeks later to determine the weight of femur, bone mineral density (BMD) and bone gla protein (BGP), alkaline phosphatase (ALP), calcium (Ca) and phosphonium (P) in serum and Ca, hydroxyproline (HOP) and creatinine (Cr) in urine.Results  The body weight, weight of femur and BMD were lower, serum BGP, ALP and urine Ca, HOP and Cr were higher in OVX and OVX+P groups than those in sham group (P＜0.05); the weight of femur, BMD and serum BGP and ALP and urine Ca, HOP and Cr in OVX+E and OVX+E+P groups had no significant differences from those in sham group (P＞0.05).Conclusions  The bone resorption and bone loss of OVX rats could not be prevented by progestin alone, but could be interrupted by estrogen and interrupted progestin regimen; interrupted progestin added do not affect the advantageous effect of estrogen on bone metabolism in OVX rats.     　　【Key words】  Osteoporosis; Postmenopausal; Ovariectomized; Estrogen; Progestin; Bone mineral density (BMD); Bone turnover biochemical markers

　　雌激素缺乏是绝经后妇女骨丢失的主要原因，性激素替代治疗能有效预防绝经后骨质疏松的发生，但长期单纯使用雌激素有一定的副作用。近年来的研究表明，雌激素加间断孕激素阻止OVX导致的骨丢失，而且避免了雌激素对子宫内膜的不利作用〔1，2〕，本实验通过对去卵巢大鼠骨质疏松模型股骨重量、骨密度（BMD）及骨转换生化指标的检测和观察，探讨雌激素加间断孕激素对去卵巢大鼠骨转换生化指标的影响，为其应用于临床提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  选取3月龄、体重（199.29±15.43）g的Wistar雌鼠(中国军事医学科学院动物中心提供)35只。随机分成5组，每组7只：①假手术 (Sham) 组，②卵巢切除 (OVX) 组，③卵巢切除+雌激素 (OVX+E)组，④卵巢切除+孕激素 (OVX+P) 组，⑤卵巢切除加雌激素和孕激素 (OVX+E+P) 组。动物条件一致，均在(22±2)℃室温、灯光12 h交替、相对湿度55%的屏障系统内饲养，给予标准全价颗粒饲料喂养。

　　1.2  实验药物  雌激素选用苯甲酸雌二醇注射液(estrodioli benzoas，E)1 mg/支 (上海第九制药厂生产)，每3 d皮下注射1次，每次注射35 μg/kg。孕激素选用黄体酮注射液(progesterone，P)20 mg/支 (浙江仙居制药股份有限公司生产)，皮下注射3 d(每天1次，每次1 mg/kg),停用3 d。

　　1.3  方法

　　1.3.1  建立模型  将大鼠以1%硫喷妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下，经腰部正中纵切口进入腹腔背侧，将②～⑤组大鼠双侧卵巢切除，①组仅行开关术。术后正常摄食水。1 w后③～⑤组开始用药，且给药剂量每周按体重校正1次，10 w后处死全部大鼠。

　　1.3.2  标本采集及测定  喂养10 w后称重、断头处死大鼠，留取全血，于低温超速离心机离心后取血清；处死前禁食，收集24 h尿液；尿液和血清均保存在-80℃冰箱中备测；分离右侧股骨，使用钮力天平（精确到0.1 g）称湿重后，以10%福尔马林固定。分别测定血清骨钙素（BGP）、碱性磷酸酶（ALP）、钙、磷，同时检测尿钙、羟脯氨酸(HOP)及肌酐(Cr)生化指标。将分离的股骨使用美国LUNAR DPXL 6843型双能X线骨密度仪测定BMD，每只测定两次，取均值。

　　1.4  统计学方法  实验数据使用SAS 6.12统计软件包进行统计学分析，计量数以x±s表示。

　　2  结果

　　2.1  各组大鼠股骨重量和BMD的比较  从表1中可以看出，实验10 w后，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组股骨重量和BMD减少（P＜0.05）；而OVX+E组和OVX+E+P组股骨重量和BMD无明显差异(P＞0.05)。与OVX组相比：OVX+E组和OVX+E+P组股骨重量和BMD明显增加（P＜0.05）；而OVX+P组则无明显差异(P＞0.05)。

　　2.2  各组大鼠实验后生化指标的对比  从表2及表3中可以看出，实验10 w后，与Sham组相比：OVX组和OVX+P组血清BGP、ALP及24 h尿钙、HOP和Cr含量升高（P＜0.05）；而OVX+E组、OVX+E+P组血清BGP、ALP、钙和磷及24 h尿钙、HOP、Cr、HOP/Cr和钙/Cr均无明显改变（P＞0.05）。与OVX组相比：OVX+E组、OVX+E+P组血清BGP、ALP及24 h尿钙、HOP和Cr含量降低（P＜0.05）；OVX+P组所有骨转换指标均无明显差异（P＞0.05）。

　　表1  各组大鼠体重的变化和股骨重量、BMD的比较（略）

　　与OVX组相比：1)P＜0.05；与Sham组相比：2)P＜0.05

　　表2  实验后各组大鼠血液生化指标的对比（略）

　　与OVX组相比：1)P＜0.05；与Sham组相比：2)P＜0.05

　　表3  实验后各组大鼠尿液生化指标的对比（略）

　　与OVX组相比：1)P＜0.05；与Sham组相比：2)P＜0.05

　　3  讨论    　　骨重建包括骨形成和骨吸收两个偶联过程，骨质疏松的发生正是这一平衡破坏或解偶联，骨吸收大于骨形成而产生。这一变化过程正可通过血和尿中的生化标志物来反映。骨代谢生化标志物主要包括与骨矿有关的标志物、与骨形成有关的标志物和与骨吸收有关的标志物三方面。骨矿物质主要由无定形钙磷混合物和钙磷羟磷灰石晶构成，通过测定血、尿钙磷含量可间接了解体内代谢情况。血清BGP和ALP是两个最常用的反映骨形成的代谢指标，而尿钙、HOP、HOP/Cr和钙/Cr则是反映骨吸收的代谢指标。ALP 50%来自于骨，是参与骨代谢的重要蛋白质，ALP的活性可以反映成骨细胞的活性。血清骨钙素水平则可用于评价骨转换率。尿中HOP50％来自骨，也有来自皮肤等，尿中HOP基本上能反映骨吸收和骨转换程度。

　　3.1  OVX导致骨吸收和骨丢失  表1显示，实验10 w后，与Sham组相比，OVX组大鼠股骨重量和BMD都明显减少。表2显示，OVX组血清BGP、ALP活性增高，表明OVX导致代偿性骨形成增强；表3显示，OVX组24 h尿Ca、HOP和Cr含量均升高，说明OVX导致骨胶原的分解代谢加快，骨吸收活性增强，但由于骨吸收大于骨形成，因而导致骨量丢失,说明OVX大鼠具有高转换型的生化特点，与临床相符。

　　3.2  ERT预防OVX的骨吸收和骨丢失  雌激素缺乏是PMO发病的主要原因，其详细机制尚未完全阐明，但已知雌激素可抑制骨吸收，减少骨丢失。1988年Eriksen等首次证实，成骨细胞上存在着雌激素受体，雌激素可直接调节骨代谢〔3〕；近年来的研究表明，破骨细胞也是雌激素的靶细胞〔4〕，雌激素通过促进破骨细胞的凋亡而调节部分骨代谢〔5〕。表1～表3显示，对OVX鼠使用ERT，无论是否加用孕激素，其股骨重量和BMD都与Sham组接近；与Shama组相比，其血清BGP、ALP、钙和磷及24 h尿钙、HOP、Cr、HOP/Cr和钙/Cr均无明显改变，表明ERT能阻止OVX导致的骨吸收和骨丢失。

　　3.3  单独使用孕激素不能阻止OVX导致的骨吸收及骨量丢失  表1～表3显示，实验10 w后，与Sham组相比，OVX+P组股骨重量和BMD减少，其血清BGP、ALP及24 h尿钙、HOP及Cr升高，说明对OVX鼠单独使用孕激素，并不能阻止OVX导致的骨吸收及骨量丢失。

　　3.4  雌激素加间断孕激素阻止OVX导致的骨吸收及骨量丢失  表1～表3显示， OVX+E+P组股骨重量和BMD均明显高于OVX组和OVX+P组而与Sham组接近；与Sham组相比，其血清BGP、ALP、钙和磷及24 h尿钙、HOP、Cr、HOP/Cr和钙/Cr均无明显改变，说明雌激素加间断孕激素阻止了OVX导致的骨吸收及骨量丢失，孕激素的加入没有影响雌激素对OVX大鼠骨代谢的有利作用。    　　表2显示，各组血清钙、磷含量无显著差异，可能与去卵巢后随着雌激素水平下降，多种内分泌激素起调节作用有关。尿钙、磷测定可直接反映体内钙磷代谢情况，但受饮食影响很大。本实验采用禁食收集24 h尿液，基本消除了饮食的干扰。表3显示，各组大鼠24 h尿HOP/Cr和钙/Cr无明显差异，可能是因为伴随尿钙和HOP的升高，其Cr也升高导致，提示用24 h尿钙、HOP评价骨量丢失，其敏感性高于HOP/Cr和钙/Cr。

【参考文献】  　1 马秀敏，郭 影，庞义存，等.雌激素联合孕激素间断应用对去卵巢大鼠的影响〔J〕.中国煤炭工业医学杂志 2002；4（5）：3947.

　　2 郭 影，底建敏，闫晓娟，等.雌激素加间断孕激素对去卵巢大鼠骨质疏松模型子宫及骨组织形态计量学的影响〔J〕.中国老年学杂志 2006；26（4）：5146.

　　3 Erisken EF，Colvard DS，Berg NJ，et al.Evidence of estrogen receptor in normal human osteoblastlike cells〔J〕.Science，1988；241:846.

　　4 Mano H，Yuasa T，Tiyazawa KK，et al.Mammalian nature osteoclast as estrogen target cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1996；223 (3)：637 42.

　　5 Kameda T，Mano H，Yuasa T，et al.Estrogen inhibits bone resorption by directly inducing apoptosis of the bone resorbing osteoclasts〔J〕.J Exp Med，1997；186(4)：48995.