雌、雄激素对雄性大鼠血脂代谢及肝血脂代谢相关酶的影响
发表时间：2009-10-22 浏览次数：569次
作者：梁东明 王建昌 李源 张婧 陈花 汪彬荣 作者单位：解放军空军老年医学研究中心,北京 100036
【摘要】 目的 探讨雌、雄性激素对雄性大鼠血脂代谢和肝血脂代谢相关酶的影响。方法 24只雄性SD大鼠(320±20) g随机分为去势对照组(ORX组)、去势二氢睾酮(DHT)(DHT组)、去势雌二醇组(E2)(E2组)和正常对照组(对照组),每组6只。ORX组、DHT组、E2组行去势手术，对照组进行假手术。DHT组皮下注射DHT溶液(06 mg·kg-1· d-1，医用玉米油为溶剂),E2组皮下注射E2(02 mg·kg-1· d-1,医用玉米油为溶剂)；对照组、ORX组注射医用玉米油(安慰剂)。各组动物饲喂高胆固醇高脂肪饮食，于14 w后处死全部实验动物，酶法测定各类脂蛋白胆固醇及血脂等指标；酶免法(ELISA)测定血浆DHT浓度，放免法检测血浆睾酮(T)、E2水平。称量各组动物的体重和肝脏湿重，取肝脏组织处理，测定血脂相关代谢酶。结果 血浆T浓度DHT组 、ORX组和E2组显著低于对照组(P＜005)；DHT水平DHT组和对照组两组间无统计学差异(P＞005)。血浆E2水平，E2组显著高于DHT组 、ORX组、对照组(P＜005)，DHT组与ORX组组间无统计学差异(P＞005)。E2组血浆TC明显高于ORX组、DHT组和对照组(P＜005)；ORX组高于DHT组、对照组(P＜005)，但DHT组与对照组间无统计学差异(P＞005)；E2 、DHT组血浆TG明显高于对照组(P＜005)；ORX组与对照组无统计学差异(P＞005)；ORX组、E2组血浆HDLC明显高于DHT组、对照组(P＜005)；DHT组与对照组无统计学差异(P＞005)；E2组血浆HDLC高于DHT组、ORX组与对照组，但DHT组、ORX组与对照组各组间均无统计学差异(P＞005)。肝脏HL、LPL、CY7PA1 mRNA表达DHT组高于E2组、ORX组与对照组，E2组低于ORX组与对照组(P＜005)。结论 雌激素降低雄性大鼠肝脏HL、LPL、CY7PA1活性，雄激素激活HL、LPL、CY7PA1的表达；雄、雌激素都影响血脂代谢，DHT 可导致TC降低，同时伴有TG升高；而E2使 TC、LDL升高。
【关键词】 雄性激素；血脂；二氢睾酮；雌二醇
The effects of androgen and estradiol on blood lipid metabolism and the correlated enzyme of hepatic blood lipid metabolism in male rats
LIANG DongMing, WANG JianChang, LI Yuan, et al
Research Center for Geriatrics, Air Force General hospital, Beijing 100032, China
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of androgen and estradiol on lipid metabolism and correlated enzyme of hepatic lipid metabolism in male ratsMethods 24 male SD rats were randomly divided into orchiectomized (ORX) control group (ORX group, injected with medical maize oil), ORX dihydrotestosterone group (DHT group, injected with medical maize oil dissolved DHT 06 mg·kg-1· d-1), ORX estradiol group (E2 group, injected with medical maize oil dissolved E2 02 mg·kg-1· d-1) and sham operation group (control group, injected with medical maize oil), 6 rats in each group All animals fed with highcholesterol and highfat diet for 14 weeks were killed to measure plasma lipid (lipoprotein, cholesterol) with enzymic method, plasma DHT by ELSIA and testosterone and E2 by radioimmunoassay (RIA) The bodyweight and fresh liver weight of all animals were measured The liver tissues were treated to detect blood lipid metabolism correlated enzymeResults The level of plasma testosterone was lower in ORX, DHT and E2 group than that in control group (P＜005) The level of plasma DHT was not statistically significant between DHT and control group (P＞005) The level of plasma E2 in E2 group was higher than that in DHT, ORX and control group (P＜005), but there was no significance between DHT and ORX group (P＞005) Plasma total cholesterol (TC) level in E2 group was significantly higher than that in ORX, DHT and control group (P＜005), while that in ORX group was higher than that in DHT and control group (P＜005), but there was no significance between DHT and control group (P＞005) Plasma triglyeride (TG) level in E2 and DHT group was higher than that in control group (P＜005), but there was no significance between ORX and control group (P＞005) Plasma highdensity lipoprotein cholesterol (HDLC) level in ORX and E2 group was higher than that in DHT and control group (P＜005), but there was no significance between DHT and control group (P＞005) Plasma lowdensity lipoprotein cholesterol (LDLC) level in E2 group was higher than that in DHT, ORX and control group (P＜005), but that in DHT and ORX had no significant difference than that in control group (P＞005) The mRNA level of cholesterol 7αhydroxylase (CY7PA1), hepatic lipase (HL) and lipoprotein lipase (LPL) in DHT group were higher than those in E2, ORX and control group, while those in E2 group were lower than those in ORX and control group (P＜005)Conclusions DHT could decrease plasma TC，while increase TG DHT could activate the expressions of HL, LPL and CY7PA1 E2 could restrain the activity of HL, LPL and CY7PA1 E2 and DHT could influence blood lipid metabolism, but E2 could enhance TC and LDL levels
【Key words】 Male sex hormone; Blood lipid; Dihydrotestosterone; Estradiol
由性激素替代治疗影响血脂的结果不一，具体的影响机制未见报道。有三个酶在血脂代谢中起重要作用，其一：肝脏胆固醇7α羟化酶作为胆固醇代谢的限速酶，在胆固醇代谢中起主要作用；其二：脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶是水解各种脂蛋白中的甘油三酯和磷酯，使各种脂蛋白颗粒的大小和密度发生变化从而影响血脂代谢。雌、雄激素影响血脂代谢，尤其是在雄性个体，但其机制尚不清楚，是否通过影响这3个酶而发挥作用有待于探讨。
1 材料与方法
11 材料 雄性纯系9周龄SD大鼠(SPF级)24只，体重(320±20)g，由军事医学科学院动物中心提供；实验试剂：二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)及雌二醇(E2)购于Sigma公司，溶剂为注射医用玉米油，由石家庄欣康制药提供)；DHT 酶免试剂盒(美国ADL 公司) 睾酮(T)、E2放免试剂盒(北京福瑞生物工程公司，批号20061001)；血脂测定用日立7600自动生化分析仪；中国科技大学中佳公司1200γ计数器；总RNA 提取试剂、反转录试剂盒、DL2000 分子量核酸、标准、PCR 试剂盒(购自北京赛百盛生物公司)；引物合成北京奥科生物技术有限公司。
12 试验方法
121 药物的配制 雌二醇(E2)、DHT分别溶于医用玉米油，配制成玉米油DHT溶液(DHT 3 mg/ml)、玉米油E2溶液(E2 1 mg/ml)。
122 实验动物分组和模型建立 将上述大鼠正常喂养适应环境7 d后，随机分为去势对照组(orchidectomized，ORX组)、DHT组、去势雌二醇组(E2组)以及正常对照组(对照组)，每组6只。硫苯妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，E2组、DHT组和ORX组行去势手术，对对照组行假手术。各组手术动物抗感染治疗7 d后，对各实验组进行以下处理：E2组皮下注射玉米油E2溶液(剂量02 mg·kg-1·d-1〔3〕)；DHT组皮下注射DHT溶液(剂量为06 mg·kg-1·d-1〔4〕)；正常对照组、去势对照组注射医用玉米油(安慰剂)。每周测量动物体重，根据体重调整药物剂量。各组给予高胆固醇高脂肪饲料(2%胆固醇，05%胆酸钠，5%蛋黄粉，15%动物油及825%标准饲料)喂养14 w，所有动物均自由摄食饮水，饲养室温度为(20±2)℃，光照时间12 h/d。
123 观察指标及测定方法 (1)观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、及死亡情况，实验结束处死动物时，称体重及肝重。(2)生物化学指标：用酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。(3)测定血浆雌、雄性激素水平：间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆DHT水平，放免方法测定血浆睾酮(T)水平(按试剂盒的操作说明使用)。(4)RTPCR测定肝脏肝脂肪酶(hepatic lipase，HL)、脂蛋白脂肪酶(1ipoprotein lipase，LPL)、7α羟化酶(7αhydroxylase，CY7PA1)mRNA的表达。
124 实验动物的处死、血浆和标本组织的处理 在大鼠处死前12 h禁食，每只动物称量体重，硫苯妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌注射器自心脏取血，血液静置6 h后，6 000 r/min离心收集血浆。称量每只肝脏重量；自同一叶取肝组织，新鲜组织生理盐水洗后，一部分立即放入液氮中，冻好后放于-70℃冰箱保存。
125 逆转录聚合酶链反应 使用总mRNA提取试剂提取总的RNA，用01% DEPC水充分溶解RNA，以紫外线分光光度仪测定260 nm、280 nm 的吸光度值(OD260 、OD280) 以估计样品量和纯度。使用Promega反转录试剂盒的反转录体系以5 μg 总RNA 反转录生成20 μl 产物,反转录体系在37 ℃反应60 min，70 ℃反应10 min，4 ℃冷浴5 min，即完成cDNA 的合成。配PCR体系扩增CY7PA1、HL、LPL，内参照GAPDH，引物序列见表1。PCR扩增体系包括：cDNA 4 μl、MgCl2 15 μl、dNTP 1μl、10×buffer 25 μl、Taq 酶 03 μl、DDW 127 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl，扩增条件：94℃预变性5 min，92℃变性1 min、58℃退火1 min、72 ℃延伸15 min，共32次循环,继续72 ℃延伸10 min。内参照GAPDH 扩增条件51℃退火1 min。取PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭1 μg/ml) 电泳,紫外灯下凝胶成像分析系统记录结果,待测基因mRNA 相对表达量以其扩增带吸光度值与相应内参照扩增带吸光度值的比值表示。
表1 酶引物序列（略）
13 统计学处理 所有计量资料以x±s表示，采用统计软件SPSS130对结果进行分析。 数据进行方差齐性检验、单因素方差分析(oneway ANOVA)，多个样本均数间两两比较采用LSDt检验。
2 结果
21 一般情况 实验期间，各组动物均无死亡，表现食欲较好，精神状态良好，毛发光泽度好；各组体重平稳增加，DHT组的行为较活跃，皮毛明显致密；E2组动物活动较少。
22 动物体重、肝指数 见表2。实验结束时各组动物体重，与其他三组比较E2组体重较轻，经单因素方差分析显示，各组体重有统计学差异(P＜005)；而DHT组、ORX组、对照组之间无统计学差异(P＞005)；各组肝指数(肝脏湿重/体重×100%)之间无统计学差异(F=2643,P＞005)。
表2 各组大鼠体重、肝指数（略）
与E2组比较：1)P＜005
23 血浆T、DHT和E2水平 见表3。血浆T水平：DHT组 、ORX组和E2组显著低于对照组(P＜005)，但E2组、ORX组、DHT组之间无统计学差异(P＞005)；血浆DHT水平：ORX组明显低于对照组(P＜005)，但补充DHT后，DHT组血浆DHT浓度明显升高，DHT水平DHT组和对照组两组间无统计学差异(P＞005)。血浆E2水平：E2组显著高于DHT组 、ORX组(P＜005)，DHT组与ORX组间无统计学差异(P＞005)，对照组与E2组组间无统计学差异(P＞005)。
24 血脂测定结果 见表3。TC：E2组血浆TC明显高于ORX组 、DHT组和对照组(P＜005)；ORX组高于DHT组、对照组(P＜005)，但DHT组与对照组间无统计学差异(P＞005)；TG：E2组 、DHT组明显高于对照组(P＜005)；ORX组与对照组无统计学差异(P＞005)；HDLC：ORX组、E2组明显高于DHT组、对照组组(P＜005)；DHT组与对照组无统计学差异(P＞005)；LDLC：E2组高于DHT、ORX与对照组，但DHT组、ORX组与对照组各组间均无统计学差异(P＞005)。
表3 各组大鼠血浆性激素水平（略） 与其他各组比较：1)P＜005
表4 各组大鼠血浆血脂（略）
与其他各组比较：1)P＜005；与对照组比较：2)P＜005
25 血脂代谢相关酶的表达 肝脏组织中LPL、 HL mRNA 表达水平：在DHT组，HL、LPL mRNA表达显著升高，DHT组表达高于对照组；但是E2组，显著降低，E2组表达低于对照组(图1)。肝脏组织中CY7PA1 mRNA的表达与HL、LPL具有同样的变化(图1) 单因素方差统计分析发现，雌、雄激素影响CY7PA1、HL、LPL的组织表达有显著差异(P＜005)。
图1 各组肝脏组织HL、LPL、CY7PA1等mRNA表达（略） 3 讨论 肝脏在血脂代谢过程中起重要作用，肝脂肪酶是由肝实质细胞合成参与脂蛋白代谢的关键酶，是脂肪酶家族中的成员之一，与脂蛋白脂肪酶、胰脂肪酶具有同源性，在血浆脂蛋白代谢中具有重要作用。肝脂肪酶活力异常可引起血浆脂蛋白代谢紊乱，与所致的冠心病及糖尿病等有较高的相关性〔5〕，胆固醇7α羟化酶是胆固醇转化为胆汁酸经典途径的关键酶，对维持机体胆固醇内稳态起着重要作用；CYP7A1、LPL、HL的活性增强能影响血浆TG和胆固醇(TC，LDLC，HDLC，VLDLC等)的水平〔6，7〕，从而调节血浆脂蛋白中的脂质代谢，抵抗高脂血症的发生，LPL的活性下降可引起高脂血症。 本实验研究显示：E2组、DHT组、ORX组血浆T水平都远远低于对照组；但E2组、DHT组、ORX组之间血浆睾酮水平无统计学差异(P＞005)，说明补充外源性DHT、E2不会影响血浆T水平，血浆E2水平ORX组、DHT组都远远低于E2组和对照组，同样DHT组、ORX组之间血浆E2水平无统计学差异(P＞005)；由于补充E2在DHT组、ORX组没有影响E2水平，因此我们在DHT组、ORX组、E2组可以观察单独DHT、E2对血脂代谢的影响。 在血脂代谢方面：ORX组TC、HDL水平高于对照组，说明去势手术后可以升高TC、HDLC、LDLC水平，与Haug等〔8〕的研究结果一致，DHT组血浆TC、HDL水平低于ORX组，DHT组与对照组血浆HDLC无统计学差异，实验结果提示非芳香化雄激素DHT生理剂量的替代治疗对血浆HDLC无影响，据此我们推断在雄性体内，雄激素可以降低血浆中的TC、LDLC；E2组血浆TC、LDL水平高于ORX组，结果提示，雌激素在雄性体内可以升高TC、LDL水平，此外在DHT组、E2血浆TG水平高于ORX组。 在肝脏血脂代谢相关酶方面：DHT组HL、LPL、CY7PA1 mRNA表达高于ORX组，在E2组HL、LPL、CY7PA1 mRNA表达低于ORX组，HL、LPL无需肽类辅因子或激活物的激活，但其活性受许多激素的影响。雄激素对有上行性调节作用，使酶活性增高；而雌激素则对HL、LPL有下行性调节作用〔9〕。CY7PA1是胆固醇代谢的关键酶，此酶激活可以加速胆固醇向胆汁酸的代谢，由此我们推断，雄激素中的DHT通过激活HL、LPL、CY7PA1从而使血脂中TC下降，雌激素通过抑制HL、LPL、CY7PA1表达从而使TC、LDL升高。 总之，在雄性大鼠雌激素降低肝脏HL、LPL、CY7PA1活性，雄激素激活HL、LPL、CY7PA1的表达；雄、雌激素都影响血脂代谢，DHT可导致TC降低，同时伴有TG升高；而E2使 TC、LDL升高。
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