一氧化氮合酶、氧化应激与糖尿病心肌病

作者           作者单位

白杨      吉林省人民医院特诊疗区

王晓璐　　吉林省人民医院特诊疗区

一氧化氮来源的活性氮族(reactive nitrogen species ，RNS)，例如过氧化亚硝酸盐,作为关键的蛋白修饰和细胞损伤的促成因素，增加氧化应激形成氧自由根在发展成特异性心肌病起着关键作用。相关的损害包括心肌细胞的结构改变。故除了胰岛素之外的抗氧化治疗有利于预防和延缓长期糖尿病并发症和糖尿病心肌病。现就糖尿病心肌病与一氧化氮合酶及氧化应激的相关性综述如下。

1 NO与心脏功能的相关性

一氧化氮(Nitric oxide，NO)在心血管系统是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)蛋白家族合成的多能性调节气体。NOS转化L-精氨酸(L-argininge)的胍基氮生成NO和副产物L-胍氨酸( L-citrulline)[1]。NO的生物合成从氧化L-argininge到L-citrulline涉及两个步骤，形成每摩尔L-胍氨酸消耗1.5 mol的NADPH和2 mol氧气。第一步反应是L-argininge的N端羟基化，产生NG-羟基-L-精氨酸(NG-Hydroxy-L-arginine,L-NHA)作为中间产物，第二步反应为中间产物L-NHA与NOS作用，生成L-胍氨酸和NO[2]。它的多重角色包括调整血管舒缩[3]，在内皮细胞表面表达粘附分子[4]，抑制血小板聚集[5]，和阻止血管平滑肌细胞增殖，限制氧化低密度脂蛋白的形成[6]。NO 涉及广泛的生理和病理过程，已经证明最好的作用是在心血管系统调节血管平衡[7-8]。而且NO对心脏功能有重要的作用，参与控制心脏收缩和心率，限制梗死后心肌重构，是缺血性预适应和缺血性后适应保护效应的原因之一。低浓度的 NO，增加心肌收缩力，而高浓度的NO，产生负性变时效应，减弱心肌收缩力[9]。

2 NOS的结构和功能

一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)在结构和功能上有三种异构酶:①神经一氧化氮合酶(nNOS 、NOS I 或 neuronal NOS);②诱导一氧化氮合酶(iNOS 、NOS II 或 inducible NOS)和③内皮一氧化氮合酶(eNOS 、NOS III 或endothelial NOS)[10]。eNOS和nNOS一般指持续表达的,钙离子依赖性酶。他们的活性主要有细胞内的钙/钙调蛋白水平调节。诱导一氧化氮合酶( Inducible NOS，iNOS or NOS II，23 130 kDa) 是在细胞因子或其他炎性物质刺激后高表达，它的活性不依赖于钙离子。其表达是通过激活巨噬细胞作为一个免疫反应诱导的[11]。

2.1 NOS的分布及催化机制：nNOS异构酶广泛分布在中枢和周围神经系统，也包括大量的非神经细胞;iNOS异构酶，初始的识别是在活化的巨噬细胞;eNOS异构酶最初的识别是在血管内皮细胞，由于它广泛的分布，也证明了存在几个非内皮细胞类型[12]。NOS 异构酶初始的特点是从特殊组织分离纯化的，所有三种初始的蛋白特点最终显示是不同基因的产物。eNOS是一个135 kDa 蛋白，是膜相关家族的唯一成员。这个结果，至少部分是通过肉豆蔻酸的共转录修饰和棕榈酸的转录后修饰。从小脑分离纯化的nNOS特点是一个150 kDa蛋白。它还有一个 PDZ区域(区域的命名来自三个蛋白：PSD9S,Dh/G 和ZO-1 ZO-2)，位于N端300个氨基酸延伸区域，可能引导这个异构酶到特殊的亚细胞定位。第三个异构酶iNOS是130kDa 蛋白，初始是从鼠科巨噬细胞分离的，与前两种异构酶相反，是持续的，通过免疫和炎性刺激在细胞表达的。成对的比较这三种异构酶的氨基酸序列显示大约50%的序列一致性。催化反应的共因子包括：(6R)-四氢化-L-生物蝶呤，黄素，血红素，非血红素铁[13]。

尽管这些异构酶拥有相似的全酶和化学特点，但是他们包含各自与众不同的催化和调节特点。NOS的功能作为一个二聚体，由两个一致性的单体构成，可分为两个主要区域： C-末端还原酶区域和N-末端氧化酶区域，C-末端区域有与细胞色素P450还原酶显著地序列同源性(P450还原酶包含一个FAD和FMN，并且包含从NADPH到细胞色素P450转运电子的血红素)。而N末端区域结合四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin ，BH4)和血红素，也是L-精氨酸底物。这两个区域之间有钙调蛋白结合位点，在酶的结构和功能上发挥关键作用[12]。C-末端区域结合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide FAD),和黄素单核苷酸(Flavin mononucleotide ，FMN)共因子。 N- 和 C-末端区域通过一个短序列结合钙调蛋白，是全NOS活性的必要变构象效应器[10]。

完整的NOS功能作为一个混合的功能单加氧酶/还原酶，有能力合成包括NO在内的大量分子，最显著的是超氧离子。孤立的C-末端还原酶区域能够传递电子从NADPH、通过黄素FAD和FMN到细胞色素C。L-精氨酸结合在血红素附近酶活化位点， BH4和血红素的结合位点定位在NOS二聚物激活形式的单加氧酶区域的表面[14]。故N-末端单加氧酶区域二聚体能够转化反应中间产物NG-羟基-L-精氨酸到NO和L-胍氨酸。因此这两个区域执行不同的催化功能[15-16]。

2.2 NOS 的心肌细胞定位：已经发现哺乳动物的心肌持续表达eNOS和nNOS;eNOS 在冠脉和心内膜的内皮细胞和心肌细胞，而 nNOS定位在心脏自主神经、神经中枢和心肌细胞。最近的进展发现eNOS和nNOS 表达在心肌不同的亚细胞部分，他们偶联不同的效应器分子，随着酶激活引发不同的效应。这是因为NO在心肌细胞弥散的距离被高细胞质浓度的肌红蛋白，限制在一个局部的环境。特别在疾病状态，通过大量的超氧离子，与NO反应限制它的生物活性。已经证明在正常生理条件下，iNOS由于低或缺陷表达，不可能在心血管系统发挥较大影响。因此NO的局部功能影响可能依赖于涉及的NOS异构酶而显著不同。此外，表达、细胞定位和激活持续的NOS异构酶可能改变心肌疾病的存在，导致功能效果的改变。心肌eNOS 绝大多数定位在心肌细胞膜穴样内陷(caveolae)、小窝蛋白( caveolin)，也定位在由NO调节的信号转导通路。心肌nNOS 最初定位在肌浆网，尽管后者的研究也发现这个异构酶结合在心肌纤维膜蛋白，特别在疾病心脏[10]。

2.3 NOS与心脏功能：NO 参与心肌的功能控制是基于复杂的NOS异构酶的空间划分：nNOS，iNOS 和eNOS,拥有不同的活性导致产生NO的浓度有百倍的不同。持续的钙-依赖性 nNOS 和 eNOS 调节产生低浓度的NO，引起心肌细胞收缩力的下降和心率的减少。相反,钙-不依赖性的 iNOS 只出现在收缩功能损害时的损伤心肌细胞。iNOS 调节产生 NO 浓度增高，与过氧化亚硝酸盐的形成和NO细胞毒素的作用相关。eNOS定位在心肌细胞膜性小腔(caveoli) 和T-小管(T-tubules)，而nNOS定位在肌浆网膜。NOS异构酶的划分促进了心肌NO-信号通路不同线路的调整，这个原则是理解心脏NO生物矛盾存在的关键。改变NOS的亚细胞划分导致了NO 合成的增加,减少它影响的特异性，瓦解了钙循环的机制，电机械解偶联和心肌收缩性衰竭[17]。

3 氧化应激

氧化应激 (oxidative stress)是活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)或自由根，也就是O-2、H2O2和OH-,在细胞内或细胞外产生的对细胞有毒性效应的一种状况。心脏是由ROS影响的主要器官之一。最近的证据显示氧化应激是心血管疾病许多方面的一个普遍的共同特性。在心脏的氧化应激中， ROS的产生增加，并且心肌细胞的防御机制在改变。心肌细胞的ROS来源于线粒体电子传递链、 NOS、NADPH 氧化酶、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)、脂氧化酶/环氧合酶和各种物质的自动氧化,特别是儿茶酚胺[18]。

4 糖尿病心肌病

1972年，提出了糖尿病心肌病的存在，其根据是四个成年糖尿病患者发生了充血性心力衰竭，而缺少可识别的冠心病、瓣膜或先天性心脏病、高血压或酒精中毒的发病依据。这种疾病潜在的恰切机制还不知道，然而，在这些心脏观察到的重要的病理学改变包括：细胞外基质蛋白，特别是胶原的积聚。这些改变的机制包括：细胞外基质蛋白的过度产生、降解减少和/或化学改变。这些效果可能是高浓度的血糖直接或间接作用的结果[19]。糖尿病心肌病的发展是多重因素的。公认的机制包括代谢紊乱，心肌纤维化，小血管疾病，自主功能紊乱和胰岛素抵抗[20]。糖尿病心肌病的标记是心脏的氧化应激，心肌炎症，心肌纤维化和心肌细胞凋亡[21]。

4.1 NOS，氧化应激与糖尿病心肌病：高血糖事件，与增加的氧化和硝基化应激相关，可触发糖尿病并发症的发展。高血糖刺激高聚糖终末产物的产生，激活蛋白激酶C，增加多元醇通路，导致超氧离子的形成增加。超氧离子与NO相互作用，形成潜在的细胞毒性过氧化亚硝酸盐(peroxynitrite)，袭击各种各样的血管内皮生物分子，血管平滑肌和心肌 ，导致心血管功能紊乱。几个基本原理推测为糖尿病心肌病的发病机理：包括氧化应激，减少NO生物利用度，增加氧自由基的产生[22]。 氧化应激改变葡萄糖代谢的角色，三种独立的生物化学通路被认为是涉及糖尿病高血糖诱导的并发症的机制。这三个通路包括血糖诱导激活PKC异构酶 [23];增加葡萄糖源性高聚葡萄糖终末产物的形成[24]通过醛糖还原酶通路增加葡萄糖流量[25]。然而，已经提出的唯一的统一机制，就是增加了ROS 的产生作为升高血糖和三个主要通路负责血糖损害[26]。Crespo MJ等，在链唑霉素诱导的糖尿病大鼠 (STZ-diabetic rats) 状态评估了NOS (eNOS and iNOS) 的地位，氧化应激，和心脏功能的相关性，从而有利于理解糖尿病心肌病的发生病因。 STZ-diabetic rats心脏的梗死面积，心脏输出量，和左室射血分数比对照组明显降低(P<0.05),而左室收缩末期容积增高。STZ-diabetic rats心脏组织的NOS活性从161±18 cpm/mg增加到286±20 cpm/mg(P<0.001)。此外，超氧化物的产生和心肌eNOS 和 iNOS水平在STZ-diabetic rats组比对照组增加(P<0.05)。证明心脏eNOS 和iNOS的活性增加伴随着心脏功能下降。因此，增加心脏的氧化应激可能是STZ-diabetic rats诱导的糖尿病心肌病的发生病因[27]。Ma.G等研究了糖尿病对心肌缺血、再灌注 (Ischemia -reperfusion，I/R) 损伤的影响。STZ-diabetic rats 2和6周后，通过左前降支闭塞30分钟后再灌注诱导I/R损伤。糖尿病后2周，梗死面积和caspase-3裂隙(一个促凋亡信号)，与正常血糖对照组或糖尿病后6周组明显下降，而毛细血管密度、VEGF水平、eNOS蛋白和心肌NO水平都增加。Akt磷酸化(一个促生存信号)在糖尿病后2周明显增加。同时，糖尿病后2周心肌脂质过氧化，硝基酪氨酸水平，过氧化亚硝酸盐等生物标记较对照组减少。而糖尿病后6周，脂质过氧化增加，VEGF和血浆NO水平比对照组或糖尿病大鼠2周组明显减少。结果显示内源性的心脏保护机制在糖尿病早期阶段瞬时激活，可以通过增强VEGF和eNOS表达，NO合成增加，保护心脏避免缺血-再灌注损伤，激活细胞生存信号，降低氧化应激[28]。

4.2 糖尿病心肌病的抗氧化治疗：当自由基的产生和细胞抗氧化防御的平衡被扰乱，而产生更多的自由基，就会引起氧化应激，从而促进细胞损伤。已经证明氧化应激在糖尿病心肌病的发病机理中发挥重要的角色，是糖尿病心肌病主要的罪犯因子。在链唑霉素诱导的糖尿病模型中，抗氧化酶的活性下降，增加了心肌脂质过氧化。Singal PK等发现普罗布考，一种抗氧化剂，能改善糖尿病心肌病的心脏功能，其作用机制是因为普罗布考增加了糖尿病动物的心肌抗氧化酶活性，降低了心肌的脂质过氧化。同时也证明普罗布考能改善血浆胰岛素水平，降低血浆葡萄糖。糖尿病状态也可导致内皮功能紊乱、视网膜病变、神经病变和肾病。 这些并发症也可以由氧化应激调节。已经证明糖尿病心肌病与抗氧化缺陷有关，抗氧化治疗可能有利于改善糖尿病患者的心脏功能[29]。Farhangkhoee H等研究发现姜黄色素( curcumin)，一种潜在的抗氧化剂，可能有益于预防糖尿病诱导的氧化应激以及随后的并发症。STZ-diabetic rats用curcumin 治疗1个月。然后分析心脏组织的eNOS和iNOS mRNA表达。氧化蛋白和DNA 损伤通过免疫组化分析硝基酪氨酸和8-羟基-2′-脱氧鸟苷 (8-OHdG) 来评价。心肌组织进一步行内皮素-1( ET-1 )mRNA 表达分析。 为了进一步描绘curcumin特点,同时也分析了微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells MVECs)，暴露在葡萄糖或葡萄糖和不同的curcumin浓度时，NOS、激活核因子-kappaB (NF-kappaB) 和激活蛋白-1 (AP-1)的表达。同时也分析氧化应激和ET-1 表达水平。结果显示糖尿病一个月引起eNOS 和iNOS mRNA 水平的上调 和心脏硝基酪氨酸和8-OHdG 免疫激活。用curcumin 治疗糖尿病大鼠减少了eNOS 和iNOS 水平与减少氧化DNA 和蛋白损伤相关。 有意义的是 curcumin进一步增加了心脏血管收缩的 ET-1。暴露在高糖中的MVECs 增加了eNOS和iNOS 水平和氧化应激。 Curcumin以剂量依赖性方式，通过激活NF-kappaB和AP-1。 阻止了 NOS 改变和氧化应激，增加了MVECs和 ET-1 水平[30]。锌有一个关键的抗氧化作用保护心脏免受各种各样的氧化应激 。糖尿病可引起显著的系统氧化应激，同时伴随着锌缺陷，增加了心脏对氧化应激的易感性。Song Y等发现锌补充战略可预防或延缓糖尿病心肌病，其可能机制包括： 锌的抗氧化作用，胰岛素功能和金属硫蛋白诱导[31]。

综上所述，糖尿病心肌病、氧化应激与NOS密切相关，糖尿病引起NOS的活性增加及心脏功能的下降，增加氧化应激可能是糖尿病心肌病的发生病因，同时抗氧化治疗可以减少氧化应激，降低NOS水平，从而延缓糖尿病心肌病的发展，为糖尿病心肌病的发展开拓了新的治疗靶向和新的研究领域。

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